[发明专利]细管高密度冷冻猪精液的方法及其产品

摘要

本发明涉及一种细管高密度冷冻保存猪精液的方法及其产品，属于动物繁殖技术领域。包括：鲜精的采集与检测、精液的预处理、精液的冷冻、冻精的解冻、解冻精子的评价程序。通过冷冻稀释液稀释并预处理猪精子后，用0.25mL细管高密度超低温冷冻保存。解冻后精子活力稳定在0.5以上，平均活力0.58，最高达0.68。采用该项技术对猪精液进行冷冻保存，冻精解冻后用于猪体外受精，获得54.3％的卵裂率和48.5％的桑椹胚发育率；与采用猪新鲜精液取得的体外受精结果无异。1支0.25mL细管所含精子量可以满足生产中1个输精剂量。对于猪种质资源的保护及在猪上推广应用冷冻精液，具有巨大的应用潜力和市场开发前景。

主权项

1、细管高密度冷冻猪精液的方法，包括：1)鲜精的采集与检测采用手握法室温下收集猪富含精子段精液，于洁净的烧杯中经四层纱布过滤后检查各项指标：活力＞0.7，畸形率＜18％，质膜完整率＞70％的精液用于冷冻保存；2)精液的预处理(1)精液的预平衡：用常温保存液ZO液或S液，按体积比1∶1稀释精液，室温避光静置1小时； 表1.常温保存液配方g/100mL ZO液 S液 葡萄糖 柠檬酸钠 柠檬酸 半胱氨酸 EDTA BSA Tris NaHCO2 1.15 1.17 0.41 0.01 0.23 0.50 0.65 0.125 4 0.37 0.24(2)精液的离心：静置后，把精液分装到15mL离心管中，以2400×g离心3min，去除上清，用作后面的冷冻处理；3)精液的冷冻(1)冷冻稀释I液的配制：葡萄糖1.5g，乳糖3g，甘氨酸0.8g，卵黄24mL，加三蒸水至100mL，现配现用；(2)冷冻稀释液II的配制：取配好的冷冻稀释I液，加入甘油，使甘油的质量比浓度为9％，置于普通冰箱冷藏室平衡；(3)冷冻保存：向离心、去上清处理的精子中加入1～4mL冷冻稀释I液，混匀，使重新悬浮的精子密度达1.5×109个/mL～6×109个/mL，置于5℃水浴中平衡1小时；同时把做好标识的0.25mL细管也于5℃平衡1小时获得等温细管；平衡结束后，稀释I液稀释过的精液中再加入冷冻稀释II液稀释，I液∶II液体积比为2∶1，充分混匀，再在5℃平衡1小时，在平衡时间还剩15min时，从液氮罐舀出液氮放到泡沫塑料盒中，泡沫塑料盒中液氮面上3cm处有支架，加盖平衡；将精液抽入等温细管中，装管后，用聚乙烯醇粉末封口，封好的细管在5℃继续平衡15min；最后，把细管均匀铺放在泡沫盒中液氮面上3cm处支架上，加盖平衡10min后细管直接投入液氮冷冻。