[发明专利]实时检测单核苷酸多态性的荧光定量PCR方法及其试剂盒

摘要

本发明提供了一种检测单核苷酸多态性的实时荧光定量PCR方法。该方法含两套引物探针的组合，定量的一套引物探针可确定待检样品的初始核酸数量，分型的另一套引物探针与其组合可确定是否发生单核苷酸多态性；体系镁离子浓度为2～10mM，Taq酶用量为5～10U/反应，UNG酶用量为1～2U/反应。根据定量标准品的Ct值制成标准曲线；将待测样品的Ct值代入标准曲线确定其初始模板拷贝数；计算某样品的定量Ct值与分型Ct值的差值，将此差值分别与野生及突变型标准品的相应差值进行比较，可确定该样品是否发生单核苷酸突变。本发明还提供了一种应用该方法的检测乙型肝炎病毒1896突变的荧光定量PCR试剂盒。

主权项

1、一种实时检测单核苷酸多态性的荧光定量PCR方法及其试剂盒，包含以下步骤：a、根据待检测靶基因的特异性的序列合成一套引物探针组合，该组合包含一对正常引物和一条探针，其中探针以该对引物之间的靶序列设计而成；b、根据待检测单核苷酸位点附近特异性序列合成的一条人工分型引物，该分型引物3’末端包含检测位点；c、根据待检单核苷酸位点附近特异性序列合成另一条对应的单核苷酸多态性PCR检测引物，所述的引物与步骤b中包含待检测单核苷酸位点的人工分型引物为一对引物；d、根据步骤b、c中两条引物中间的特异性靶序列合成一条特异性的探针，该探针荧光标记基团与步骤a中荧光标记基团具有不同波长；e、使用步骤a中的引物探针组合、步骤b中的引物、步骤c中的引物和步骤d中的探针及其他PCR反应成份组成双重荧光PCR反应体系，其中体系中镁离子浓度为2～10mM，Taq酶用量为5～10单位/反应，UNG酶用量为1～2单位/反应；f、从待检测物中提取DNA，或者提取RNA然后反转录成cDNA，加入到e中的反应体系中去，混匀离心后放置到双色或双色以上荧光PCR仪上，准备反应；g、步骤f中的反应体系按荧光PCR反应条件经过30～50个循环结束，每个循环的延伸过程中荧光扫描设备会收集反应过程中步骤a中合成探针以及步骤d中合成探针的荧光增值和相对应的循环次数，并记录下来；h、同时用系列阳性和阴性样品，经过步骤f中的样品处理和PCR反应，根据步骤g中得到的标准品的步骤a中探针的荧光增值，将该荧光增值结合样品的初始模板量的自然对数值做图，并制成标准曲线；i、用上述步骤g中获得的各个样品的步骤a中合成探针的荧光增值，可以在标准曲线上查到各样品的初始模板拷贝数；j、上述步骤g中获得的各个样品的步骤a中合成探针的循环次数的Ct值与步骤g中获得的各个样品的步骤d中合成探针的循环次数的Ct值的差值，即ΔCt值，将此ΔCt值分别与野生标准品的ΔCtw值及突变标准品的ΔCtM值比较，可以判断样品的该单核苷酸位点是否突变甚至突变基因占在总检测样品中的比例。