[发明专利]华南沿海七种巨蛎属牡蛎的PCR－RFLP鉴别方法

摘要

对华南沿海七种巨蛎属牡蛎的PCR－RFLP鉴别方法，首先利用大量测序的华南地区牡蛎种类的16S rDNA和COI序列，通过DNAstar中的MapDraw软件分析，选取适合的内切酶组合；随后进行基因组DNA提取和目的片段的PCR扩增，最后利用选取的内切酶对PCR产物酶切和琼脂糖凝胶电泳检测，结果与标准带谱进行对比，判定结果；它适用范围广，操作简单，对仪器设备要求低，检测快速，更准确，相比形态学方法可靠性高。

主权项

1.一种对华南沿海七种巨蛎属牡蛎的PCR-RFLP鉴别方法，其特征是首先利用大量测序的华南地区牡蛎种类的16S rDNA和COI序列，通过DNAstar中的MapDraw软件分析，选取适合的内切酶组合；随后，进行基因组DNA提取和目的片段的PCR扩增；最后利用选取的内切酶对PCR产物酶切和琼脂糖凝胶电泳检测、证实，具体步骤如下：(1)选取内切酶组合对华南沿海巨牡蛎属种类，根据其已获得的16S rDNA和COI序列，通过ClustalW进行序列比对发现和检测不同种类间序列的差异，应用MapDraw软件分析，选出内切酶组合，其中对16S rDNA片段挑选出Dde I/Dra I和Alu I/Mse I两组双酶切组合，对COI序列片段挑选出Nis I/Alu I和Nis I/Dde I两组双酶切组合；(2)基因组DNA提取A.取闭壳肌组织0.1克，加入700ul抽提缓冲液中在37℃下消化过夜；B.用等体积的比例为25∶24∶1的酚-氯仿-异戊醇混合液，充分振荡混匀，12000g/分，离心10-15分钟；C.取上清液，重复步骤B；D.加入等体积的氯仿，混匀，12000g/分，离心5-10分钟；E.取上清液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积3M的乙酸钠；F.12000g/分，离心12-20分钟，去上清液，70％乙醇洗涤1-2次；G.让乙醇彻底挥发，将基因组DNA沉淀溶于50ul无菌纯净水，即得基因组DNA，4℃保存备用；(3)目的片段PCR扩增PCR反应体系为50ul，包含5ul 10×buffer，0.6ul 2.5U/ul Taq酶，100ng基因组DNA，引物为0.2uM，dNTP为0.2mM，Mg2+为2mM；PCR反应条件为，先预变性94℃ 2分钟，而后进行94℃变性45秒，对COI 48℃或对16S 50℃复性1分钟和72℃延伸1分钟，共进行35个循环，最后72℃延伸7分钟，得扩增样品；扩增16S和COI基因片段两对通用的引物分别为：16SarL/16SarH：5`-CGGTGTTTATCAAAAACAT-3`/5`-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3`；COIL1/COIH：5`-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3`/5`-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAA TCA-3`；(4)酶切反应应用Dde I/Dra I和Alu I/Mse I两组酶对16S rDNA扩增片段分别进行双酶切反应，反应体积为20ul，包含2ul 10×buffer，对Dde I/Dra I组合反应Dde I和Dra I酶各0.5ul，对Alu I/Mse I组合反应Alu I和Mse I酶各0.5ul，17ul的16S rDNA扩增样品；分别在金属恒温浴上37℃，反应2小时；应用Nis I/Alu I和Nis I/Dde I两组酶对COI扩增片段分别进行双酶切反应，反应体积同为20ul，包含2ul 10×buffer，对Nis I/Alu I组合反应Nis I和Alu I酶各1ul，16ul的COI扩增样品；对Nis I/Dde I组合反应Nis I和Dde I酶分别为1ul和0.5ul，16.5ul的COI扩增样品；分别在金属恒温浴上37℃，反应2小时；酶切结果的标准带谱：太平洋牡蛎16S rDNA在Dde I/Dra I和Alu I/Mse I，COI扩增片段在Nis I/Alu I和Nis I/Dde I酶切下的带谱分别为：316bp+117bp+100bp、203bp+150b、167bp+161bp+134bp+125bp、284bp+160bp+142bp+115bp；按同样顺序，葡萄牙牡蛎带谱分别为：316bp+117b+100bp、242bp+150bp、167bp+161bp+134bp+125bp、426bp+160bp+115bp；香港巨牡蛎带谱分别为：316bp+117bp+100bp、150bp、269bp+157bp+111bp、426bp+111bp；有明牡蛎带谱分别为：355bp+100bp+78bp、150bp+82bp、157bp+145bp+122bp+111bp、284bp+142bp+111bp；熊本牡蛎带谱分别为：217bp+216bp+100bp、242bp+150bp、268bp+145bp+134bp+122bp、535bp+164bp；C.iredalei带谱分别为：216bp+117bp+100bp、150bp+82bp、259bp+194b+167bp、426bp+153bp+115bp；C.iredalei sp带谱分别为：216bp+100bp+71bp、125bp+99bp、259bp+145bp+111bp、272bp+153bp+111bp；(5)琼脂糖凝胶电泳检测取7ul酶切过的16S rDNA和COI序列酶切反应液，用2.5％琼脂糖凝胶在120V下，电泳2-3小时检测，直到DNA片断清晰分离；同时加DNA Ladder，以及没切的16S rDNA或COI扩增片段做对照；结果与标准带谱进行对比，判定结果。