[发明专利]原位荧光环介导恒温核酸扩增快速检测方法

摘要

本发明公开了一种原位荧光环介导恒温核酸扩增快速检测方法，包括如下步骤：将细胞用3％多聚甲醛固定10－18h；再将细胞悬浮液滴加到用0.01－0.1％多聚赖氨酸浸泡过且风干的玻板孔中，风干；在固定有细胞的玻板孔中依次加入乙醇溶液、溶菌酶溶液、蛋白酶K及RNA酶处理；将配制好的核酸扩增反应物滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；63－65℃恒温反应；最后加1mg/ml4，6－联脒－2－苯基吲哚染料，放置于荧光显微镜下观察，观察到细胞发出荧光者为阳性，无荧光者为阴性。本发明的原位荧光环介导恒温基因扩增快速检测方法无需增菌、特异性高、快速、灵敏度高，可以实现样品原位检测并且鉴定简便。

主权项

1.一种原位荧光环介导恒温核酸扩增快速检测方法，其特征在于，按如下步骤进行：(1)将细胞悬浮于磷酸缓冲液中，10000-12000rpm离心2-3分钟，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞2-3次，3％多聚甲醛固定10-18h；再将细胞悬浮液滴加到用0.01～0.1％多聚赖氨酸浸泡过且干燥的玻板孔中，风干；(2)在(1)中得到的固定有细胞的玻板孔中依次加入30-60％、60-80％、80-100％的乙醇溶液各放置1-2分钟后倒弃；再加入0.3-0.7mg/ml的用样品预处理液溶解的溶菌酶溶液，放置10-15min后倒弃；然后加入0.1-0.3μg/ml的蛋白酶K，放置5-15分钟后倒弃；最后加入0.5-1mg/ml的RNA酶，放置15-20分钟后倒弃；(3)在(2)中得到的固定有细胞的玻板孔中加入10pmol/μl引物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，Bst DNA聚合酶0.5μl，模板DNA2μl，加水至25μl，聚酯封层；63-65℃恒温反应1-1.5h；(4)在(3)中反应后的玻板孔中加入1mg/m14，6-联脒-2-苯基吲哚染料，放置10-15分钟，然后用无菌水漂洗2-3次，每次10-15分钟，自然干；(5)将(4)中得到的玻板孔置于荧光显微镜下观察，观察到细胞发出荧光者为阳性，无荧光者为阴性。