[发明专利]利用甲壳素－戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法

摘要

本发明公开了一种甲壳素－戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的制备方法，它包括甲壳素载体的精制、交联试剂的配制、甲壳素－戊二醛的交联、壳聚糖酶的提取及固定等步骤；即首先精制甲壳素载体，然后经戊二醛交联后，将所提取的游离壳聚糖酶进行固定。本发明克服了单独采用吸附或交联法所产生的载体吸附力弱、易解吸脱落以及酶易失活的缺点；同时与其它酶固定化方法相比较，具有半衰期长，固定化体系受外界环境影响小等特点。

主权项

1.一种利用甲壳素-戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法，其特征在于它是利用甲壳素为酶固定的载体，戊二醛为交联试剂固定游离壳聚糖酶，即首先精制甲壳素载体，然后经戊二醛交联后，将所提取的游离壳聚糖酶进行固定，其具体步骤如下：a、固定化载体甲壳素的精制将分子量为2.0-2.5×104片状的甲壳素研磨成颗粒，过20-60目筛，室温下用蒸馏水浸泡过夜，第二天抽滤，加入3-7mol/L HCl浸泡18-30hr，抽滤，加入0.1-2mol/L NaOH，煮沸1-3hr，用蒸馏水冲洗至中性，加入0.005-0.1mol/LNaOH溶液在30-60℃浸泡2-6hr，抽滤；加入0.005-0.1mol/L醋酸溶液于30-60℃浸泡1-4hr，抽滤；用蒸馏水冲洗至中性，60-90℃下干燥，得到精制的甲壳素；b、交联试剂的配制选用保存在4℃以下，生产时间为10-30d以内的戊二醛分析纯试剂配制交联剂，使用的有效时间为2-5个月；将浓度为2-6％的戊二醛试剂与壳聚糖酶适宜pH值5.0-7.0醋酸缓冲液混合，配成交联试剂；c、甲壳素的交联称取0.1-0.5g的精制甲壳素为载体，加入上述得到的交联试剂1-5ml，室温下浸泡并搅拌1-5hr，静置过夜，离心去上清液；将载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素；交联后的载体浸泡在pH值5.0-7.0的缓冲液中，4℃下静置，贮藏备用；d、游离壳聚糖酶的提取(1)摇瓶发酵培养产酶将培养好的假单胞菌(Pseudomonas)CUY8种子接入摇瓶发酵培养；发酵培养基为：接种量5-12％，葡萄糖2-6％，壳聚糖0.5-4％，NaCl 0.1-2％，FeCl2 10-30×10-5g/mL，MgCl210-35×10-5g/mL，酵母膏0.1-0.7％，(NH4)2HPO40.8％，pH值6.0-8.0，温度30-40℃，100-150r/min条件下振荡培养1-4d；(2)游离壳聚糖酶的制备经10-50％丙酮沉淀后的壳聚糖酶通过Sephadex G-25柱层析浓缩后，再经Sephadex G-100柱层析进一步纯化收集壳聚糖酶蛋白，将酶蛋白溶解在1-4ml的0.01-0.1mol/L的乙酸缓冲液后，冰浴抽真空，浓缩真空干燥后保藏备用；e、游离壳聚糖酶的固定化将步骤(c)的交联甲壳素溶液过滤除去溶剂，取出0.1-0.5g交联甲壳素载体，加入含有1-10mg的游离壳聚糖酶液，于4℃下静置，期间每隔0.5-3hr取出搅拌一次，离心取沉淀，即得固定化酶。