[发明专利]制备α1－抗胰蛋白酶的方法

摘要

本发明提供了一种原料来源丰富、价格低廉，纯度较高、操作简便的α₁－AT制备方法。本发明采用了如下步骤：(1)抽提蛋白，(2)杂蛋白的变性处理，(3)分离杂蛋白，(4)病毒灭活，(5)纯化，(6)超滤、配制、去病毒来制备α₁－AT。本发明采用血浆分离的废弃物即低温乙醇分离法所获得的组分IV为原料，获得具有治疗价值的α₁－AT，从而提供了人血浆的综合利用能力，降低生产成本，提高经济效益；在纯化 α₁－AT过程中，采用了还原剂如DTT、弱阴离子交换树脂及苯基琼脂糖凝胶，可获得高纯度的α₁－AT；在生产过程中采用了巴斯消毒法进行病毒灭活，同时运用15～20nm膜过滤去除病毒，从而使产品的安全性得到保证。

主权项

1.一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：(1)抽提蛋白：低温乙醇分离法所获得的组分IV沉淀溶于pH8.60～8.90的90～110mM Tris+10～20mM NaCl缓冲液中，其w/v比例为1∶3～5，在2～8℃条件下搅拌1～2h后，用滤器压滤，得滤液a；(2)杂蛋白的变性处理：滤液a中加入还原剂即1，4-二硫苏糖醇，使其浓度为10～30mM，反应温度控制在2～8℃，pH为8.60～8.90，搅拌2～4h后用滤器压滤，得滤液b；(3)分离杂蛋白：A、滤液b过DEAE-Sephrose或DEAE-SephroseFF阴离子交换柱进行纯化，其层析柱用pH8.40～8.80、20～80mM的Tris缓冲液平衡，样品的pH控制在8.40～8.80；B、用pH7.20～7.80、20～80mMTris缓冲液清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；C、选用pH7.20～7.80、NaCl浓度为0.03～0.07M的20～80mMTris缓冲液洗脱，温度控制在室温，分别收集洗脱峰，可获得含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液A；(4)病毒灭活：洗脱液A中加入保护剂，保护剂为盐类、糖类、氨基酸或其混合物，采用巴斯德消毒法即在60℃作用10小时进行病毒灭活；(5)纯化：A、病毒灭活后液体中加入固体硫酸铵，使其浓度达到0.8～1.2M，室温下搅拌10～20分钟后过滤，得滤液c；B、滤液c上疏水层析柱，使用苯基琼脂糖凝胶、辛基琼脂糖凝胶，柱子先用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液平衡；C、用pH7.30～7.70、含0.8～1.2M硫酸铵的30～70mM Tris缓冲液清洗柱子，一般洗3～5个柱体积；D、选用含0.3～0.6M硫酸铵的30～70mMTris，其pH7.30～7.70的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到含α1-抗胰蛋白酶的洗脱液B；(6)超滤、配制、去病毒及制备：洗脱液B用10000分子量超滤膜进行超滤透析，透析液为pH6.6～7.4、含25～45mM氯化钠、2～5％甘露醇的10～30mM磷酸缓冲液，后浓缩α1-抗胰蛋白酶溶液，所有操作在2～8℃条件下；用透析液将蛋白含量调整到20～50mg/ml，采用15～20nm膜过滤去除病毒，并除菌过滤后分装。