[发明专利]基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法

摘要

本发明涉及一种基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法。dU或dI寡核苷酸探针序列特征是：全长30－40个核苷酸，5’端第15－25位的一个核苷酸与待检SNP位点配对，3’端第1－15位的一个核苷酸为dU或dI，dU或dI距离待检SNP位点5－15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待检SNP位点及其两侧核苷酸配对。反应组份包括dU或dI寡核苷酸探针，待测单链DNA，热稳定性mutS蛋白，报告DNA模板分子、报告DNA特异性的引物，dNTPs，pfuDNA聚合酶及其反应缓冲液。dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA杂交后，若SNP位点处形成错配碱基，则PCR可扩增出报告DNA，若SNP位点处形成正确配对碱基，则不能扩增出报告DNA。根据报告DNA扩增结果，可推定待测SNP位点碱基种类。

主权项

1.一种基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)设计合成测定单核苷酸多态性的dU或dI寡核苷酸探针，dU或dI寡核苷酸探针的序列特征是：探针全长30-40个核苷酸，5’端第15-25位的一个核苷酸与待测单链DNA的待检单核苷酸多态性位点配对，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI核苷酸，dU或dI核苷酸距离待检单核苷酸多态性位点5-15个核苷酸，整条寡核苷酸探针与待测单链DNA的SNP位点及其两侧核苷酸配对；2)设计合成用于扩增报告DNA的特异性正向引物和反向引物，引物的序列特征是：整条引物与报告DNA模板分子中报告DNA两端的碱基序列配对；3)采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链DNA，聚合酶链式反应体系组成：热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测单链DNA模板分子、待测单链DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶，其中待测单链DNA特异性引物中的一条采用5’端生物素标记；扩增双链DNA后，将双链DNA变性，与采用链亲和素包被的磁珠温育，在变性条件下洗涤磁珠，再用生物素溶液洗脱结合在磁珠上的待测单链DNA；4)在pfu DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应缓冲液中，加入待测单链DNA、dU或dI寡核苷酸探针、热稳定性mutS蛋白、报告DNA特异性的正向引物与反向引物、报告DNA模板分子、dNTPs和pfu DNA聚合酶，配制单核苷酸多态性测定反应混合物；5)将单核苷酸多态性测定反应混合物进行聚合酶链式反应，扩增报告DNA，测定待测单链DNA待测位点的单核苷酸多态性；6)将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶中，水平电泳检测报告DNA扩增结果；若加入的dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA在单核苷酸多态性位点处正确配对，则扩增不出报告DNA；若加入的dU或dI寡核苷酸探针与待测单链DNA在单核苷酸多态性位点为错配碱基，则可以扩增出报告DNA；根据报告DNA扩增结果，推定待测单链DNA待测位点单核苷酸多态性。