[发明专利]用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法

摘要

本发明是用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法。培养基各组分的重量百分比及条件：斜面培养基(％)：牛肉膏0.1－0.5，蛋白胨0.5－2.0，氯化钠0.2－0.8，琼脂1.5－3.0；种子培养基：牛肉膏0.1－0.5，蛋白胨0.5－2.0，氯化钠0.2－0.8；液体发酵培养基(％)：蔗糖1.5－4.0，酵母膏0.2－2.0，蛋白胨0.5－2.0，氯化钾0.05－0.1，尿酸0.05－0.07。菌株经斜面培养，种子培养，液体发酵培养，收集菌体，采用聚乙二醇－硫酸铵双水相萃取和两步层析纯化即得到磷酸甘油氧化酶。

主权项

1、用产朊圆酵母菌在诱导培养基中生产尿酸酶的方法，利用产朊圆酵母菌在培养基种生长，并在生长过程中收集产生的尿酸酶，其特征在于：一、菌株采用产朊圆酵母2.281；二、培养基组分及各组分的重量百分比：斜面培养基：牛肉膏0.1-0.5，蛋白胨0.5-2.0，氯化钠0.2-0.8，琼脂1.5-3.0种子培养基：牛肉膏0.1-0.5，蛋白胨0.5-2.0，氯化钠0.2-0.8液体发酵培养基：蔗糖1.5-4.0，酵母膏0.2-2.0，蛋白胨0.5-2.0，氯化钾0.05-0.1，尿酸0.05-0.07三、培养条件菌株在25-30℃斜面培养基上培养24-30小时，接入种子培养基，25-30℃，200转/分钟，振荡24-36小时活化，随后于三角瓶中培养，将种子液按10％比例接入液体发酵培养基中，每瓶含100毫升培养液，27-30℃，200转/分钟，培养18-24小时，收集发酵培养液，经4,000转/分钟，离心5分钟，收集菌体；四、菌体破碎将发酵液按照5000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，称取菌体湿重，并按重量/体积＝1∶4的比例悬浮在50摩尔pH8.5硼酸-硼砂缓冲液中，冰浴条件下超声波50kHz，600W，破碎3次，每次破碎5秒，间隙3秒，持续30分钟，破碎液于4℃下离心12000转/分钟，离心15分钟，弃沉淀，得到粗级抽提液；五、分离纯化①聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取：体系组成：25％m/m聚乙二醇1000，9％m/m(NH4)2SO4，2％m/mNaCl，pH7.5，尿酸酶在上相的收率为93％，分配系数为1.22，纯化为15倍；②二乙基氨基乙基-纤维素-52层析：柱规格5.0cm×7.0cm，用pH8.5 20.0摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡，上样流速1.5毫升/分钟，上样毕，用同样缓冲液流速4.0毫升/分钟洗杂蛋白，然后以0～0.3摩尔NaClpH8.520毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸进行直线梯度洗脱，流速2.0毫升/分钟，检测，收集酶活性峰部分；③黄嘌呤-琼脂糖亲和层析：层析柱床体积1.0ml，用含0.5毫摩尔乙二胺四乙酸，2毫摩尔α-巯基乙醇，pH8.5 50.0摩尔硼酸缓冲液充分平衡，样品上柱后，用含0.05摩尔NaCl的上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白，然后用含0.5毫摩尔尿酸pH8.5 50.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，流速10.0毫升/小时，收集酶活性峰部分，即得本发明所说的尿酸酶。