[发明专利]利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法

摘要

本发明公开了一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法，其主要步骤为：A.属间杂种的获得，首先是叶肉原生质体的分离；其次是原生质体的纯化；第三是原生质前处理及融合；第四是原生质体培养及杂种鉴定繁殖；B.野芥细胞质雄性不育恢复品系的选育；C.野芥细胞质雄性不育及恢复性状向十字花科蔬菜的转育；D.野芥细胞质雄性不育杂交生产，即以油菜或十字花科蔬菜的野芥细胞质雄性不育系为母本，以雄性可育的油菜或十字花科蔬菜品种为父本，进行有性杂交生产F1杂种种子，用于提高油菜F1代的营养体产量或种子产量。本发明方法易行，鉴定和筛选恢复材料快、恢复率高，三系配套容易，成本低，制备的杂交种纯度高。

主权项

1、一种利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂交种的方法，包括以下步骤：A、属间可育杂种的获得：首先是叶肉原生质体的分离：甘蓝型油菜及野芥的种子经消毒后/置70％的乙醇1分钟，1.5％的次氯酸纳10分钟，无菌水冲洗3次，接种在MS培养基上培养，置25℃、16小时60-80μmolm-2s-1光照条件下生长，取展开的叶片用于原生质体的分离，酶解时在5cm的培养皿中加入3.5ml SCM溶液/0.5M山梨醇，10mM CaCl2，5mM MES，pH5.8，用刀将叶片划成羽状后加酶液/0.2M甘露醇，80mM CaCl2，2％的纤维素酶，1％的Macerozyme，0.5％的Driselase，25℃避光酶解14-18个小时，晃动；其次是原生质体的纯化：用孔径为200或400目的细胞筛过虑，加W5/154mM NaCl，125mMCaCl2，5mM KCl，5mM葡萄糖混匀至离心管中，离心，弃上清液收集原生质体，用蔗糖+MES、0.5M蔗糖，1mM MES溶液重新悬浮，在上层加入W5，离心，取两界面之间的原生质体带，再用W5悬浮，离心；第三是原生质前处理及融合：利用5mM的碘乙酸处理近缘种原生质体20-45分钟，密度均调至2×106pp/ml，将PEG融合液/15％PEG，60mM CaCl2，90mM甘露醇，25mM甘氨酸，10％DMSO成对滴入培养皿中，将已处理的两亲本原生质体等体积混匀，加2-3滴在成对的融合液中间，两边再各加1滴融合液，共培养，随后将上述混和原生质体用W5+MES稀释，收集原生质体于离心管中，用W5洗涤，离心，再用液体PellB悬浮原生质体，将调整密度为105pp/ml；第四是原生质体培养及杂种鉴定繁殖，在PellB平板上倒一层细胞悬浮液，放上饲养膜，将原生质体溶液滴在饲养膜上，吸去清水，密封，暗培养10-15天，待长成细胞团后，将细胞团逐个转至PellC平板上，5-7天后将长成3-5mm的小愈伤，转入PellE诱导芽，出芽后将幼芽转至PellF中继续生长，当幼苗出现叶片后，转至MS培养基上诱导生根，得到生根后的再生植株；B、油菜野芥细胞质雄性不育恢复品系的选育：首先是杂种可育株的鉴定和纯化，将再生植株移栽到温室或大田，进行性状鉴定，花期观察育性，选有花粉的育株套袋自交，获得F2种子，或利用甘蓝型油菜品种的花粉给再生出来的杂种植株授粉，获得回交一代/BC1种子，种植F2及BC1种子，选择F2及BC1群体中的育株，继续套袋自交或通过小孢子培养纯合基因型，获得性状为一致的育株系；其次是野芥胞质恢复品系的鉴定，以育株系为父本，给野芥细胞质雄性不育系的不育株授粉进行测交，获得测交一代杂种，种植杂种鉴定育性，杂种的育性得到恢复的，父本株系为恢复系，恢复系自交繁殖成为群体，即育成油菜野芥不育胞质的恢复品系；C、油菜野芥细胞质雄性不育及恢复性状向十字花科蔬菜的转育：是野芥细胞质不育系为细胞质供体，以十字花科蔬菜白菜、甘蓝为父本，连续回交4代获得十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育系及其保持系，以步骤B中选育的野芥不育胞质的恢复品系为恢复基因供体，与十字花科蔬菜进行有性杂交，在杂交种自交后的F2后，选取单株与野芥胞质不育材料测交鉴定恢复性能，筛选获得十字花科蔬菜野芥不育胞质恢复品系；D、野芥细胞质雄性不育杂交种生产：首先是不育系的繁殖，以油菜或十字花科蔬菜的野芥细胞质雄性不育系为母本，以油菜或十字花科蔬菜的品种为父本，连续回交4代，繁殖油菜或十字花科蔬菜野芥细胞质雄性不育系，形成一对不育系和保持系，继续繁殖不育系；其次是不育杂交种的生产，以繁殖的不育系为母本，油菜或十字花科蔬菜品种为父本，按不育系和品系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，生产出不育的杂交种种子，用于杂种蔬菜的生产；第三是可育杂交种的生产：以本步骤A中繁殖的不育系为母本，按不育系和恢复系4∶2或5∶2或6∶2的行比种植，开花期辅以人工或蜂媒传粉，终花期砍去父本，收获不育株行的种子，生产出的杂交种种子，用于杂种油菜和蔬菜的生产。