[发明专利]一种分离棉花叶绿体DNA的方法

摘要

本发明属于棉花基因工程技术领域，具体涉及一种分离棉花叶绿体DNA的新方法。包括：以幼嫩的叶片为材料，用普通家用榨汁机将叶片充分匀浆，利用A、B、C、D四种缓冲溶液，常规速度离心，依次通过完整叶绿体的分离，裂解及叶绿体DNA(cpDNA)分离纯化三个连续步骤，最终获得棉花叶绿体DNA纯品。本发明制备分离的叶绿体DNA质量较高，紫外分光光度计检测表明，本发明制备的DNA样品的D₂₆₀nm/D₂₈₀nm在1.6－1.8之间；产率高达1－10μg cpDNA/g叶片样品。经过验证，以分离的cpDNA为模板完全能够满足特异性酶切、RAPD、PCR和目标基因序列的克隆等常规分子生物学操作的需要。与现有技术相比，本发明不需要超高速离心机，也不需要通过蔗糖密度梯度离心分离等设备和步骤。

主权项

1.一种分离棉花叶绿体DNA的方法，其特征在于，从棉花叶片的叶肉中分离出完整的叶绿体；对所述的叶绿体进行裂解，得到叶绿体DNA粗品，对该叶绿体DNA粗品进行纯化，得到叶绿体DNA纯品，按照以下步骤制备：1)取幼嫩棉花叶片作为分离叶绿体的材料，将叶片置于4℃冰箱中黑暗处理24h，然后用于分离叶绿体或将该叶片转入到-70℃冰箱保存备用，取适量叶片，用冰块预先使榨汁机冷却，然后加入样品4倍体积预冷的4℃缓冲液A于榨汁机的容器中，迅速将样品投入缓冲液A中，启动榨汁机，匀浆约1min，然后用医用纱布过滤该匀浆，得到滤液；2)将步骤1)的滤液分装到离心管中，于4℃下2500rpm离心10min，弃上清，得到沉淀；3)向步骤2)的沉淀中加入缓冲液B，用移液枪吸打使沉淀悬浮，然后将悬浮液分装到的塑料离心管中，在4℃下2500rpm离心10min，弃上清；4)用缓冲液C将沉淀重新悬浮，并将悬浮液转移到塑料离心管中，加入缓冲液C，4℃下2500rpm离心10min，弃上清，沉淀即为棉花叶绿体；5)向步骤4)得到的叶绿体沉淀中加入缓冲液D，充分悬浮，得到悬浮液；6)向步骤5)的悬浮液中依次加入终浓度为0.5％的十六烷基磺酸钠，终浓度为2％的十二烷基肌胺酸钠和浓度为10mg/ml的125μl蛋白酶K，充分摇匀，于37℃，保温3h，在保温期间间隔半小时轻轻摇动该悬浮液，得到含有cpDNA的消化液；7)向步骤6)得到的消化液中加入体积比为25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，抽提2-3次；8)取上清液加入终浓度为0.02mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置过夜，1000rpm离心30min，收集沉淀，用70％乙醇冲洗一遍，室温放置15min，12000rpm离心5min，风干叶绿体DNA，将叶绿体DNA溶于400μl的pH为8.0的TE溶液中，然后加入30ul的RNA酶(5mg/ml)，37℃，保温2h.；9)再向步骤8)得到的经RNA酶消化的溶液中加入等体积氯仿，抽提2-3次，上清液加入终浓度为0.02mol/l醋酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇，挑出叶绿体DNA，用70％乙醇浸泡2-3小时，浸泡期间用70％乙醇洗涤2-3次，弃去乙醇，风干，加TE溶液溶解，用分光光度计测定DNA浓度和纯度，得到提纯的叶绿体DNA；其中，缓冲液的组分及配比如下：缓冲液A按重量体积计：Tris 6.1g/L，EDTA 9.3g/L，Nacl 73.1g/L，抗坏血酸 44.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮， 15.0g/L，补充水分至1L，调pH至3.6；缓冲液B按重量体积计：Tris 6.1g/L，EDTA 9.3g/L，Nacl 73.1g/L，β-巯基乙醇 0.78g/L，牛血清蛋白 1.0g/L，补充水分至1L，调pH至8.0；缓冲液C按重量体积计：150mmol/L Nacl 8.8g/L，100Nacl EDTA 37.2g/L，补充水分至1L，调pH至8.0；缓冲液D按重量体积计：Tris 6.1g/L，EDTA 9.3g/L，二乙基二硫代氨基甲酸钠 1.0g/L，补充水分至1L，调pH至8.0。