[发明专利]一种快速高通量的基因定点诱变方法

摘要

本发明提出了一种快速高通量的基因定点诱变方法，其步骤为：1.构建了一个表达DpnI限制性内切酶的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的用于定点诱变的菌株；2.根据需要对基因待突变的位置进行序列分析，设计部分重叠(10～16nt)的PCR诱变引物；3.反向PCR扩增；4.扩增后的PCR产物直接化学法转化上述构建的表达DpnI的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样经过DpnI体内筛选就可以得到携有预定突变的质粒。 本发明能够真正做到简单快速的定点诱变，且不需订购特殊修饰的引物，不需要对PCR后的产物进行任何处理步骤(酶切连接，体外杂交，胶回收和体外DpnI的消化处理等)就能方便迅速地构建突变质粒。

主权项

1.一种快速高通量的基因定点诱变方法，其特征在于步骤为：一、构建了一个表达DpnI限制性内切酶的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的用于定点诱变的菌株；首先通过λ-Red重组酶介导的同源重组，用抗性基因替换大肠杆菌染色体上的编码DNA腺嘌呤甲基化酶的基因，得到DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株；其次，用PCR的方法合成了编码DpnI的基因dpnC，并将此基因克隆到温度敏感型的质粒载体上，构建了表达DpnI的质粒；再次，将此质粒转化上述构建的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样就得到了表达DpnI的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株；二、设计部分重叠的PCR诱变引物；根据需要对基因待突变的位置进行序列分析，合理设计一对PCR诱变引物，分别称为正向诱变引物和反向诱变引物，其中在选定的位点引入了新的预定突变的核苷酸，另外这对引物在5‘端重叠10～16nt，这样通过反向PCR扩增后，得到线形的携有预定突变的产物在末端就会带有10～16nt的同源区，在转化大肠杆菌后，依靠大肠杆菌中不依赖Rec-A的同源重组就可以实现此PCR产物的自环化；三、反向PCR扩增；以上述设计的这对PCR诱变引物，对克隆了目的基因的环状质粒模板进行反向PCR扩增；四、扩增后的PCR产物直接化学法转化上述构建的表达DpnI的DNA腺嘌呤甲基化酶缺陷的菌株，这样经过DpnI体内筛选就可以得到携有预定突变的质粒。