[发明专利]农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法

摘要

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及苜蓿遗传转化方法。建立了两种苜蓿遗传转化方式，一是超声辅助农杆菌介导转化苜蓿下胚轴胚性愈伤的遗传转化方法，即以苜蓿下胚轴诱导的愈伤组织经过悬浮培养方式，超声辅助，在培养基中筛选体胚，由体胚萌发、发芽、生根，最后获得转化植株。二是农杆菌介导转化苜蓿幼嫩真叶遗传转化方式，以苜蓿幼嫩的真叶作为转化受体材料，用农杆菌介导转化，在愈伤诱导培养基中筛选，将抗性愈伤组织接种到分化培养基中诱导出体胚，体胚萌发、发芽、生根，获得转化植株。本发明克服了固体培养基培养下胚轴时获得的胚性愈伤不均一的弊端，也显著的提高了苜蓿的遗传转化效率，缩短了遗传转化周期。

主权项

1、农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法，其特征是应用超声辅助农杆菌介导苜蓿下胚轴遗传转化方法：应用材料：1)苜蓿种子为公主岭1号；2)菌株和质粒：农杆菌菌株LBA4404和转化载体pBI121；含有目的基因SsNHX1-蓬的Na+/H+逆向转运蛋白基因的转化载体pBI121；方法步骤：1)苜蓿种子首先要经过细砂纸打磨5-6次，然后用75％酒精浸泡处理10分钟，倒掉酒精后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1％升汞处理20分钟，倒掉升汞用无菌水冲洗5-6次，最后将无菌种子接种到成份为Ms盐+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的发芽培养基中，在25℃条件下，弱光培养1天；2)待下胚轴长出时用手术刀将其切下，大约长度为0.5毫米左右，然后将下胚轴接种到成份为Ms盐+UM有机+CH 2克+2.4-D 2毫克/L+KT0.25毫克/L+3.0％蔗糖+0.58％琼脂，pH5.8的固体诱导培养基中培养20-30天左右，当愈伤组织生长成组织密实、颜色浅绿时为宜；3)将合适的愈伤组织接种到成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖，pH5.8的液体诱导培养基中悬浮培养，每间隔5-7天换一次新鲜的培养基，摇床转速维持在150转为宜，需要适当补充光照。大约20-30天左右时，大量的、均一的胚性愈伤组织生长成熟；4)在含有目的基因的农杆菌LBA4404平板中挑取单菌落接种到3毫升YEB液体培养基中，过夜培养，再取1毫升转到50毫升的YEB液体培养基中培养，待生长到光密度值为0.6左右时，离心4000转，10分钟，收集菌体，待用；5)收集菌体用成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖，pH5.8共培养液体培养基50毫升重悬两次；6)将胚性愈伤组织10个为一批装到2.0毫升的小离心管中，管中盛有成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖，pH5.8600的微升液体共培养培养基，将装有胚性愈伤组织的小离心管放到超声仪中，参数为100mHz处理8秒中，然后，快速将管中的液体培养基吸出，迅速加入1毫升的农杆菌重悬液，侵染30分钟；7)将浸染过的胚性愈伤组织平放在成份为Ms盐+UM有机+水解酪蛋2克+2.4-D 2毫克/升+KT0.25毫克/升+3.0％蔗糖+乙酰丁香酮100微摩尔/升+3.0％蔗糖+0.4％琼脂，pH5.8的半固体共培养基中暗培养3-5天，温度为25℃。8)将共培养后的胚性愈伤组织接种到成份为Ms盐+NAA0.05毫克/升+6-BA 0.5毫克/升+3.0％蔗糖+头孢霉素300毫克/升+卡那霉素50毫克/升，0.58％琼脂，pH5.8的分化培养基培养50-60天，胚性愈伤组织经过四个胚期生长成成熟的体胚，在此期间每隔20天换一次新鲜的培养基；9)将成熟的体胚外植体再转入成份为Ms盐+头孢霉素300毫克/升+3.0％蔗糖+0.58琼脂，pH5.8的萌发培养基中萌发，培养条件为25℃，18:6光周期，大约20-30天左右，体胚生长出完整地转化植株，当植株长到10厘米左右时炼苗移栽