[发明专利]鸡γ－干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

摘要

本发明公开了密码子优化后的鸡γ－干扰素基因序列、鸡γ－干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定，构建了表达鸡γ－干扰素的重组杆状病毒rBac－ChIFN－γ，采用鼠抗原核表达重组ChIFN－γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测，表明ChIFN－γ在重组杆状病毒rBac－ChIFN－γ感染的sf9昆虫细胞中获得表达。抗病毒活性试验显示，结果表明：重组ChIFN－γ在重组杆状病毒rBac－ChIFN－γ感染的昆虫细胞中获得良好表达，并具有高效抗病毒活性。

主权项

1.鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达，其特征在于将GeneBank中提交的鸡γ-干扰素基因序列进行密码子优化并人工合成得到pMD-18T-ChIFN-γ，EcoR I和Sal I双酶切pMD-18T-ChIFN-γ，将编码ChIFN-γ基因DNA克隆至pFastBacTM1，构成pFastBacTM1-ChIFN-γ；将pFastBacTM1-ChIFN-γ转化DH10Bac，提取质粒，PCR筛选阳性重组杆状病毒基因组克隆rBacmid-ChIFN-γ，制备阳性重组基因组克隆DNA，采用CellfectinRReagent(Invitrogen)转染sf9细胞，待细胞出现病变后，按文献[12]介绍的方法进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提病毒基因组DNA，M13-48f(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’)和M13-47r(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’)为引物PCR验证ChIFN-γ基因在纯化病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-ChIFN-γ；上述rBac-ChIFN-γ种毒液按1∶10体积比感染新鲜制备sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞用PBS洗涤重悬后滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。分别以1∶100稀释鼠抗原核表达重组ChIFN-γ免疫血清和相同倍数稀释的非免疫小鼠血清为一抗；PBST(0.05％Tween20)洗涤后加入1∶50倍稀释荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜观察结果。