[发明专利]抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明属于抗体的制备，特别是指一种抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备方法。包括人间皮素B细胞抗原表位的多参数预测及抗原肽合成、抗人SMR单克隆抗体的制备等工艺步骤，解决了目前仍无可以检测可溶性间皮素的单克隆抗体的问题。具有制备的抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体(2H10和6D9)，经免疫细胞化学和免疫印记分析该抗体具有较高的特异性。为进一步利用酶联免疫对可溶性间皮素相关蛋白进行检测奠定了基础等优点。

主权项

1、抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下工艺步骤：A、人间皮素B细胞抗原表位的多参数预测及抗原肽合成(1)单参数分别预测分析间皮素氨基酸序列全长，应用Hopp & Woods亲水性参数、Welling抗原性参数、可及性参数、二级结构对抗原表位分别进行单参数预测，均高于域值的峰为预测出的位点；其中间皮素氨基酸序列全长如下：1 malptarpll gscgtpalgs llfllfslgw vqpsrtlage tgqeaapldg vlanppniss61 lsprqllgfp caevsglste rvrelavala qknvklsteq lrclahrlse ppedldalpl121 dlllflnpda fsgpqactrf fsritkanvd llprgaperq rllpaalacw gvrgsllsea181 dvralgglac dlpgrfvaes aevllprlvs cpgpldqdqq eaaraalqgg gppygppstw241 svstmdalrg llpvlgqpii rsipqgivaa wrqrssrdps wrqpertilr prfrrevekt301 acpsgkkare ideslifykk weleacvdaa llatqmdrvn aipftyeqld vlkhkldely361 Pqgypesviq hlgylflkms pedirkwnvt sletlkalle vnkghemspq aprrplpqva421 tlidrfvkgr gqldkdtldt ltafypgylc slspeelssv ppssiwavrp qdldtcdprq481 ldvlypkarl afqnmngsey fvkiqsflgg aptedlkals qqnvsmdlat fmklrtdavl541 pltvaevqkl lgphveglka eerhrpvrdw ilrqrqddld tlglglqggi pngylvldls601 mqealsgtpc llgpgpvltv lalllas(2)综合预测应用抗原性指数分析曲线与上述步骤(1)中的方法对照，以避免误差，最终确定了抗原位点的氨基酸序列为Q D L D T C D P R Q L；(3)抗原肽的合成利用酪氨酸具有两个氨基的特殊结构，先合成具有4个氨基末端的酪氨酸核心，肽链从C端向N端延伸，以每个氨基为起点按预先选定的氨基酸序列合成；B、抗人SMR单克隆抗体的制备(1)小鼠脾细胞制备将硝酸纤维素膜制成膜片，在含SMR复合肽抗原的溶液中浸泡过夜，初次背部皮下免疫BALB/c小鼠，分别于初次免疫后10～14天、20～28天后进行两次加强免疫，末次免疫后3～10天，在无菌条件下取出脾脏，研磨使脾细胞游离，采用GKN缓冲液洗涤后离心，沉淀的细胞用10～30ml无血清DMEM培养液重悬，放入二氧化碳培养箱中待用；(2)骨髓瘤细胞制备SP2/0骨髓瘤细胞株在融合前先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，取小鼠腹腔细胞为饲养细胞，并调整细胞浓度为1～3×105/ml，提前24～48小时置于培养板中培养；细胞融合当天，收集处于对数生长期的SP2/0细胞，加入无血清DMEM培养基10～30ml进行离心，用10～20ml无血清DMEM培养基重悬浮细胞，测定细胞活性；(3)细胞融合将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶7～10的比例混合，用无血清培养液洗涤、离心后弃去上清，在室温下将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再加入37℃的PEG 0.5～3ml作用0.5～3分钟，加无血清培养液0.5～10ml，中止PEG作用，加无血清DMEM 3～10ml离心，去上清；加入含20％牛血清的HAT培养基，使细胞达0.5～10×106/ml；加入含饲养细胞的培养板中，在10～200μl/孔、37℃、5％二氧化碳孵育箱中培养；(4)检测抗体效价用间接ELISA法检测各孔产生抗SMR抗体的阳性克隆；(5)抗体的大量制备对阳性克隆细胞采用限界稀释法进行单克隆培养；抗体的大量制备采用小鼠腹腔注射法，先于BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，2～4周后腹腔注射1～10×106个杂交瘤细胞，接种细胞10～15天后收集腹水，离心取上清液，冻存。