[发明专利]超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽的方法

摘要

本发明属于棉花转基因技术领域，公开了超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽的培育转基因棉花的新方法。包括：将剥掉种皮消毒后棉种接种到无菌苗萌发培养基上，将刚萌发两片子叶剥离，置润湿的无菌滤纸上，将10ml 0.5 OD_600nm的农杆菌菌液加入到塑料离心管或玻璃小三角瓶中并将剥好的胚芽加到农杆菌液中，将离心管或者小三角瓶放在超声波清洗器中的中央，用100－150W的超声波处理1－5min，将处理过的胚芽转移至共培养培养基培养，再用含头孢霉素的无菌水冲洗，吸干胚芽表面水分，转移至恢复培养基上，在光照下恢复培养得到幼芽，将其转到选择培养基继代，得到抗性芽，将其切下转移至生根培养基上诱导生根或嫁接在棉花砧木上，得到再生转基因植株。本发明将GFP(绿色荧光蛋白)基因在胚芽的瞬时表达率提高100多倍；首次实现了海岛棉(长绒棉)的转基因植株；获得了一批转抗虫基因的棉花植株。分子及田间实验检测表明，外源基因已经稳定转入到受体棉花基因组中并能稳定表达和遗传。

主权项

1、一种超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽的方法，其步骤包括：(1)将棉花种子剥掉种皮后消毒，接种到无菌苗萌发培养基上，培养24h，使其萌发；(2)在无菌条件下将刚萌发种子的两片子叶剥离，置润湿的无菌滤纸上，保湿备用；(3)将10ml 0.5 OD600nm的农杆菌菌液加入到塑料离心管或玻璃小三角瓶中，然后将剥好的胚芽加到所述的农杆菌液中，封好口；(4)将塑料离心管或小三角玻璃瓶放在超声波清洗器中的中央，用100-150W的超声波处理1-5min；(5)将步骤(4)处理过的胚芽转移至共培养培养基中培养72h，再用含有头孢霉素的无菌水冲洗3遍；(6)用无菌滤纸将步骤(5)的胚芽表面水分吸干，转移至恢复培养基上，在光照条件下恢复培养7天左右，得到萌发的幼芽；(7)将步骤(6)得到的幼芽转到选择选择培养基上，筛选3次，每月更换一次新鲜的选择培养基，得到抗性芽；(8)将步骤(7)获得的抗性芽切下转移至生根培养基上使其生根或者将所述的抗性芽嫁接在棉花砧木上，得到再生植株，培养基的组分及配比如下：无菌苗培养基：1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L，补充水分至1L，pH5.95；共培培养基：MSB+激动素0.1mg/l+葡萄糖3％+Phytagel 0.25％，补充水分至1L，pH5.8；恢复培养基：MSB+激动素0.1mg/l+葡萄糖3％+头孢霉素400mg/l+Phytagel 0.25％，补充水分至1L，pH 5.8；选择培养基：MSB+激动素0.15mg/l+葡萄糖3％+Phytagel 0.3％+卡那霉素100mg/l，补充水分至1L，pH5.95；生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖1.5％+Phytagel 0.25％，补充水分至1L，pH5.9。