[发明专利]一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法

摘要

本发明涉及一种快速扩提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明设计一种用于快速从大量有代表性的根际土提取AM真菌基因组DNA方法。首先通过湿筛法去除根际土大量的PCR扩增制约因子，收集根际土中AM真菌相关结构用于DNA的提取，经机械破壁后加入CTAB促进DNA释放，经Chelex－100树脂的进一步纯化。本提取方法具有方便、简单、快速的特点，并且DNA提取量多、具可浓缩纯化等优点，提高了PCR扩增成功率。通过本发明成功地从100g根际土中提取到AM真菌的环境DNA，以此为模板通过nested－PCR克隆到根际土中AM真菌目的基因片段。本发明能够快速提取植物根际土中丛枝菌根真菌环境DNA，具有良好的应用前景。

主权项

1.一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法，包括根际土中AM真菌相关结构的收集、真菌基因组DNA的提取、用AM真菌特异性引物进行nestedPCR扩增、及扩增片段测序及测序结果分析步骤，其特征在于本方法中所用根际土AM真菌DNA由下列方法得到：a.称取100g根际土壤样品，经湿筛倾析法收集AMF厚垣孢子及根外菌丝结构，并将其置于无菌的研钵中，用液氮冷却材料，待水份蒸发后，加入少量石英砂，充分研磨材料使之呈粉末状，然后迅速将粉末状的材料转入2ml的离心管中；b.在装有材料的离心管中加入65℃水浴预热的2×CTAB提取液1ml，使材料完全分散在提取液中，在65℃水浴锅中温浴1小时，期间每20分钟摇匀1次；c.将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入300μl等体积的苯酚-氯仿颠倒混匀，然后6500转/分钟离心20min；d.取上清液10μl转移到另一0.5ml的离心管中，再加入300μl 20％Chelex-100树脂混匀，置于99.9℃的PCR仪上煮沸15min；e.待样品冷却至室温，瞬时离心30s，取上清液稀释20-100倍置于-20℃冰箱中保存备用或直接作为DNA模板进行PCR扩增。