[发明专利]野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法

摘要

本发明是野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法。经过栽培稻的杂交、胚挽救和壮苗培养、栽野杂交后代的花粉培养和分子标记辅助选育等过程培养得到野生稻远缘杂交高效优良后代。本发明的远缘杂交的成活率高，杂种后代早期先回交然后再自交，有利于克服野生稻与栽培稻杂种内基因组差异引起的生殖障碍，把更多的野生稻遗传性状稳定在栽培稻中，花粉培养可以加快杂交后代的纯合稳定，建立的分子标记辅助选育，使选育能在不受环境条件和生长发育时期的限制而准确地进行。

主权项

1.一种野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法，其特征在于按以下进行：(1)、栽培稻的杂交、胚挽救和壮苗培养1)分批对栽培稻进行播种，以调节栽培稻的花期与野生稻的花期相遇，在栽野杂交中以栽培稻作为母本，野生稻作为父本进行杂交；在栽培稻开花前，剪去颖壳1/3，挑去花药后进行套袋；在对母本进行授粉前先收集一定量的母本花粉使其自然死亡，再用已经死亡的栽培稻花粉与野生稻花粉混合对母本进行授粉套袋，使母本成功授精；在受粉的第2天开始，连续3-5天对受粉穗进行喷施浓度为50mg/L-100mg/L的GA3溶液，每天喷施3次，当幼胚长到10天左右时，取下幼胚进行胚挽救；2)水稻胚挽救：在水稻上采用受精后10-15天的杂种胚，用无菌水漂洗幼胚1-2次后，用75％酒精消毒30秒，再用0.1％的升汞灭菌5-10分钟，后用无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干，剥离幼胚，接种在培养基上；胚挽救过程在无菌条件下进行，幼胚接种在培养基上28-30℃下暗培养4-7天，待幼胚出芽后再进行光照培养；3)壮苗培养：当幼苗长到3-5cm时，把幼苗转到壮苗培养基上，培养4周后，使苗长粗壮即可练苗处理，在原培养基中继续放置2天后洗去根部培养基再练苗3天，再移植到温室盆栽，1个月后基本成活；(2)、栽野杂交后代的花粉培养1)材料的选取：取杂交后代的F2、F3植株的幼穗，出穗约0.5-1.5cm，穗子外包一层保鲜膜后，及时放入取样箱中；2)培养前样品处理：将穗子基部剪去2-4cm，放入加有蒸馏水的试管或培养瓶中，再置于5℃冰箱中，在5℃条件下放置5-10天，提高愈伤组织诱导率；3)材料的灭菌：在超净台上剥开穗子，穗子用75％乙醇浸泡10秒钟，再用5％的次氯酸钠灭菌8-10min，无菌水清洗5-6次，无菌滤纸吸干水分，剪开颖壳，挑取花药接种于愈伤组织诱导培养基上；4)愈伤组织的诱导培养：花粉培养愈伤组织诱导培养基培养，培养条件为26℃-28℃黑暗诱导培养，8周后观察并统计诱导率；5)愈伤组织继代培养：将生长旺盛的米黄色愈伤，接至继代培养基上，培养条件为26℃黑暗培养，每4周继代一次，继代次数为1-3次为宜；6)秋水仙碱处理愈伤组织：继代培养2周后的愈伤组织，在无菌条件下用0.1％-0.5％秋水仙碱浸泡，再放回26℃培养箱培养48-72小时，完毕后吸去多余的秋水仙碱，接种在分化培养基上再生植株；7)双单倍体植株的分化培养：经秋水仙碱处理后的愈伤组织分化培养4-8周后，在分化培养时有部分愈伤褐化死亡，部分愈伤可恢复生长，每周观察记载愈伤组织生长分化情况，2个月左右可统计其植株再生率，每4周更换一次培养基直至分化出苗，培养条件为：温度25℃-26℃，每天光照10-12小时，光照强度为40-50umol/m2.s；8)壮苗、练苗及移栽：当分化苗长到约5cm时，转入不加任何激素的MSO培养基中，约4周后苗可长到10-15cm，可以进行练苗，加10-20mL水入培养瓶中，加透气封口膜，练苗2-5天，可移植温室盆栽，在最初5-10天用薄膜覆盖以保湿，定时通风透气，20-30天成活后可移栽到大田，进行观察、鉴定，能正常结实的为加倍的DH植株，在收获后的下一代可进行分子标记辅助选育；(3)、分子标记辅助选育1)实验材料普通野生稻：具有A′A′染色体组型，多年生，宿根，具有匍匐茎，株高可达179cm，结实率低，有高节位分蘖，分蘖能力非常强，长势旺，具有高产QTL；匍匐茎质硬而壁厚中空，节间微紫，着粒稀，长芒，花药长、柱头紫色外露，谷粒黄、黑、褐色，有边成熟边落粒的特点；栽培稻：生长整齐、清秀，较耐肥、稳产，分蘖力比普通野生稻差，分蘖成穗率高，属多穗型品种，穗均匀，结实率高，空秕率29％，全生育期191d，较早熟，抽穗较同类地区种植品种早6-8d；株高78.3-94.8cm；采用2个亲本杂交的DH群体材料，植株的高低，结实率高低和分蘖率高低均与普通栽培稻作为对照进行划分；所用的筛选出的16个引物为：引物长度均为10bp，分别是：Opc15、Oph20、Opn01、Opn03、Opn05、Opn08、Opn10、Opn13、Opn17、Opn18、Opn19、Opt02、Opt04、Opt12、Opt13、Opy13；2)用现有方法提取水稻总基因组DNA；3)反应体系DNA模板约20ng，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl2 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，12.5μmol/L随机引物1.0μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加ddH2O至25μl；扩增程序为：92℃预变性2min后，92℃变性45sec，40℃退火75sec，72℃延伸90sec，共45个循环，最后72℃再延伸5min；PCR反应在美国MJ RESEARCH公司生产的PTC-200上进行；扩增产物用浓度为2.0％的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统拍照后读取DNA条带进行数据分析；4)RAPD数据整理及分析将RAPD扩增产物的每一条带视为一个形态性状，有带出现时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，将数据输入Popgen软件包中，根据所得遗传距离，UPGMA法进行聚类，并绘制树状图；5)建立分子标记5).1遗传多样性分析，进行株高、结实率和分蘖率的多样性分析；5).2分子标记辅助选育：在F3代的DH群体的后代，苗期选取许多株系的植株叶片，取叶片提取的总DNA样品，然后用该样品为摸板，上述确定的株高、分蘖率、结实率的紧密连锁的RAPD分子标记，进行PCR扩增，然后进行电泳观察，当出现相应的PCR条带，留下具有需要的株高、分蘖率、结实率遗传特性的苗继续培养，淘汰没有对应PCR条带的植株苗。