[发明专利]橡胶树胚性组织长期继代增殖方法

摘要

本发明公开了一种橡胶树胚性组织长期继代增殖方法，它是一个将胚性愈伤及心形胚阶段以前的胚性组织，通过组培继代达到高效增殖和长期保存的方法，其工艺过程包括继代胚性组织的选取与处理过程、胚性组织的继代增殖过程、胚性组织的复状过程、继代后的胚性组织诱导成成熟胚的过程。本发明工艺流程简单，生产成本低，胚性组织增殖率高，可继代时间长，解决了常规橡胶树组织培养技术中成胚率低的难题，弥补了橡胶花药和内珠被组培外植体取材受季节等自然条件限制的缺点，为橡胶树转化技术提供了新的技术路线，也为建立橡胶花药悬浮培养和橡胶原生质体培养提供依据，因此具有重要的应用价值。

主权项

1、一种橡胶树胚性组织长期继代增殖方法，它包括继代胚性组织的选取与处理过程、胚性组织的继代增殖过程、胚性组织的“复状”过程、继代后的胚性组织诱导成成熟胚的过程，其特征在于：1)、继代胚性组织的选取与处理过程是指在橡胶树花药组培或内珠被组培的基础上，取花药或内珠被脱分化愈伤经胚诱导过程约3～4个月后初生的新鲜及健康的胚性组织进行继代培养；所述胚诱导过程包括脱分化愈伤组织诱导和胚性组织诱导，脱分化愈伤组织诱导是指选取橡胶花发育阶段处于单核晚期的雄花或橡胶果幼嫩的种子，用60～80％乙醇溶液表面消毒30～60秒钟，再以0.1～0.2％升汞浸10～20分钟，最后用无菌水清洗3～6次，然后剥出花药或切取种子内珠被接种于愈伤组织诱导培养基上，暗培养30-60d后转入胚诱导培养基；胚性组织诱导是指转入胚诱导培养基的脱分化愈伤经3-4个月的暗培养后，会从部分脱分化愈伤上长出新鲜、松散、黄色、透明的胚性愈伤，之后从这些胚性愈伤中进一步分化出棒状、球形、心形、鱼雷形胚等胚性组织；所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将下列组分比例更改为：KNO31600mg/L、NH4NO31000mg/L、CaCl2170～250mg/L、0.5mg/L叶酸、0.5mg/L D-生物素、150mg/L谷氨酸、5％椰汁、7％蔗糖，然后按比例添加有0.5～4ppm 2，4-D、0～2ppm NAA、0.5～2ppm KT；所述胚诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减半，微量元素加倍，然后按比例添加有水解酪氨酸100～300mg/L、麦芽糖2～9％、蔗糖0～9％，激素为0.5～3ppm BA、0.5～3ppm KT、0.2～1ppm NAA、0.2～1ppm GA、0.1～0.5ppm ABA；2)、胚性组织的继代增殖过程是指将选取的生长良好的胚性愈伤或鱼雷形胚以前生理阶段的胚性组织接种到继代增殖培养基上培养，培养室温度保持在24～28℃，暗培养，20～40天继代1次；所述继代增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，并将下列组分比例更改为：KNO31600mg/L、NH4NO31000mg/L、CaCl2250mg/L、0.5mg/L叶酸、0.5mg/L D-生物素、150mg/L谷氨酸、7％蔗糖，然后按比例添加激素0.5～4ppm 2，4-D、0.5～3ppm KT、0～3ppm NAA、0～1ppmTDZ；3)、胚性组织的“复状”过程是指采用复状方法来实现胚性组织延长继代时间，保持增殖效率的方法；所述复状方法是：①缩短继代时间；②在继代增殖培养基内再加入0.1～1ppmTDZ；③将继代组织转入胚诱导培养基内培养1～3个月后，再转入继代增殖培养基内继代；4)、继代后的胚性组织诱导成成熟胚的过程是指将经过多次继代和复状的胚性组织转入橡胶胚诱导培养基中培养1～4个月，胚性组织发育成成熟胚。