[发明专利]一种提高花生仁中白藜芦醇含量的方法

摘要

本发明公开了一种提高花生仁中白藜芦醇含量的方法，步骤包括(1)克隆花生中全长白藜芦醇合成酶基因；(2)获得专一性的在花生子叶中表达的特异性启动子Arah1P；(3)构建植物双元表达载体pHT711；(4)植株转化；(5)转基因花生仁的获得；(6)转基因花生仁中白藜芦醇含量的测定。本发明技术路线简单、明确、易操作，成本低，基因的表达明显，花生仁中白藜芦醇含量显著提高。

主权项

1.一种提高花生仁中自藜芦醇含量的方法，步骤包括(1)克隆花生中全长白藜芦醇合成酶基因；(2)获得专一性的在花生子叶中表达的特异性启动子Arah1P；(3)构建植物双元表达载体pHT711；(4)植株转化；(5)转基因花生仁的获得；(6)转基因花生仁中白藜芦醇含量的测定；其特征是：所述花生中全长白藜芦醇合成酶基因克隆中是以花生基因组DNA为模板，以RS1p1：5’-TCC ATG GTG TCT GTG AGT GGA ATT C-3’；RS1p2：5’-GTA TTA TAT GGC CAT GCT GCG GAG-3’为引物进行PCR，其中PCR反应程序是：94℃10min，94℃40s，55℃30s，72℃2min，30循环，72℃10min；所述专一性的在花生子叶中表达的特异性启动子Arah1P是以花生基因组为模板，以Arah1P1：5’-TTA GGT TTT CCA TTT TTA CAC AGA G-3’；Arah1P2：5’-GCA GAA ACT GAAGCC AGG ACA AGG A-3’为引物，通过PCR的方法获得；其中PCR反应程序是：94℃ 10min，94℃ 40s，56℃ 30s，72℃2min，30循环，72℃10min；所述构建植物双元表达载体pHT711的方法是：对载体pCAMBIA1301进行改造，通过以Arah1P替换原有CaMV35S组成型启动子，构建成中间载体pHT710，再将获得的白藜芦醇合成酶基因构建入载体单克隆位点，获得组织特异性表达载体pHT711；所述植株转化是将带有特异性启动子与目的基因的载体pHT711通过基因枪、电击、花粉管通道、或农杆菌介导的方法转化花生植株；所述转基因花生仁的获得方法是将获得的第一代花生种子进行播种，对获得的第二代种子取样，分别对其DNA、RNA、蛋白质进行多级检测，筛选得到转入白藜芦醇合成酶转基因的花生仁；所述转基因花生仁中白藜芦醇含量的测定方法是指以白藜芦醇标准品为对照，用高效液相色谱法对筛得的转基因花生仁中白藜芦醇含量进行测定。