[发明专利]一种检测脂肪酶活力抑制率的方法

摘要

本发明公开一种检测脂肪酶活力抑制率的方法。本发明方法包括如下步骤：A.准备试剂、橄榄油乳化液及测定酶液；B.建立脂肪酶测活体系；C.绘制脂肪酶抑制率“Y％”与pH变化幅度“ΔpH”关系标准曲线；D.样品溶液脂肪酶抑制率检测。本发明的检测方法是以脂肪酶活力为靶点，以对脂肪酶活力抑制程度为指标，根据脂肪酶作用原理，建立了一种检测脂肪酶抑制率的方法。此测定方法简便、灵敏、可靠、靶点明确、机理清楚，可以用于大量筛选各种具有脂肪酶抑制作用的物质，更进一步地用于筛选和开发减肥降脂药物。

主权项

1.一种检测脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于该方法包括如下步 骤： A.准备试剂、橄榄油乳化液及测定酶液： 三羟甲基氨基甲烷缓冲液制备：取三羟甲基氨基甲烷3-4重量份，用0.1 mol/L盐酸溶液调pH值至7.5-9.5，加水至400-600体积份，摇匀，再调节 pH值至7.5-9.5，定容至400-600体积份； 橄榄油乳化液的制备：取橄榄油10-15体积份与阿拉伯树胶20-25重量 份，研磨均匀，加水研磨至200-400体积份，用18000转/min的匀质机乳化 1-3次，每次2-4分钟；取乳剂在显微镜下检查，90％乳粒的直径在3μm以下， 并不得有10μm的乳粒，即可； 牛胆盐溶液的制备：精密称取牛胆盐5-10重量份，置于50ml烧杯中， 以水溶解，转移至100ml容量瓶中定容； 氢氧化钠溶液的制备：精密称取氢氧化钠1-3重量份，加水溶解定容至 500重量份； 脂肪酶溶液的制备：精密称取标准脂肪酶于容量瓶中，用冷却至5℃以 下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解，制成每1ml中含胰脂肪酶10～200活力 单位的溶液，作为酶原液备用；绘制标准曲线时，将酶原液用三羟甲基氨基 甲烷缓冲液稀释至不同浓度梯度的测定酶液；0U/ml的测定酶液是在水浴中 煮沸15-30分钟的酶原液，也可以用三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替； B.建立脂肪酶测活体系： 1).空白溶液脂肪酶测活体系：取橄榄油乳液20-30重量份、牛胆盐溶 液1-3重量份与水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加空白溶液1-3重量 份，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8-10，空白溶液是水、乙醇或其 它溶剂； 2).样品溶液脂肪酶测活体系：取橄榄油乳液20-30重量份、牛胆盐溶 液1-3重量份与水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加样品溶液1-3重量 份，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8-10，样品溶液是用相应的空白 溶液溶解或提取的具有潜在的抑制脂肪酶活力的物质的测定溶液； C.绘制脂肪酶抑制率“Y％”与pH变化幅度“ΔpH”关系标准曲线： 绘制标准曲线时，先将不同梯度的测定酶液换算成对应的抑制率，抑制 率换算公式： Y(％)＝(X₀-Xn)/X₀Y(％)—表示脂肪酶抑制率 X₀—表示酶原液浓度(U/ml) Xn—表示不同稀释度的酶液浓度(U/ml)； 设定酶浓度为零时，抑制率为100％；设定酶原液浓度的抑制率为0，将 酶原液按一定梯度稀释成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、 40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的测定酶液，则对应的抑制率Y％分 别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％；空白酶液(0U/ml) 是在水浴中煮沸15-30分钟的酶原液或是用三羟甲基氨基甲烷缓冲液代替， 按照标准曲线绘制法绘制标准曲线； 标准曲线绘制法：将上述空白溶液脂肪酶测活体系在35-40℃水浴中保 温5-15分钟，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至8-10；精密量取上述 不同浓度梯度的测定酶液1体积份，分别加至空白溶液测活体系中，在35-40 ℃水浴中准确反应2-30分钟，同时记录反应前后pH值，并计算反应前后的 pH差值；用酶浓度为100U/ml时反应前后的pH差值，分别减去酶浓度为 90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、 10U/ml、0U/ml时反应前后的pH差值，即得到对应不同抑制率的pH变化 幅度“ΔpH”值；以抑制率“Y％”为纵坐标，“ΔpH”值为横坐标，绘制脂 肪酶抑制率“Y％”与pH变化幅度“ΔpH”关系标准曲线，并得到相应空白 溶液的抑制率计算公式；