[发明专利]米根霉无载体固定化细胞培养方法

摘要

本发明公开了米根霉无载体固定化细胞培养方法，步骤如下：(1)进行高浓度孢子接种，形成浓的孢子悬乳液；(2)控制通气条件，生成一定数量的菌球体；控制培养基中钠与钾离子比例，使米根霉菌丝球扩增、保持细胞形态稳定；添加甲基硅油材料，形成一定直径的菌球体细胞；菌球体截流，得米根霉无载体固定化细胞；(3)获得的菌球体转接大罐时，控制其菌球体的更新与数目的扩增。本发明的优点在于：①悬浮培养体系中所形成菌球体的形状规则、大小较均一，②细胞集聚成菌球体的条件温和可控，③菌球体细胞密度大于10⁴个/L，细胞活力大于95％，④容易实现大规模培养，⑤可节约大量固定化载体成本。

主权项

1.米根霉无载体固定化细胞培养方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)米根霉孢子的准备将米根霉菌株(Rhizopus oryzae/AS 3.819)划线接种于马铃薯葡萄糖PDA平板，第一天设置培养温度为32℃，相对培养湿度70％；第二天设置培养温度为34℃，相对培养湿度为30％，待黑色浓密孢子完全覆盖白色菌丝后即可准备收集，制得成熟米根霉孢子；(2)米根霉孢子乳悬液的制备将250mL三角瓶斜面上的所有米根霉孢子刮下接种于带有直板式搅拌桨的5L发酵罐中，利用血球计数板计数确保接种后的发酵罐中的孢子乳悬液浓度超过106个/mL，其中钠与钾离子比例为1∶1，制得米根霉孢子乳悬液；罐内培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖120g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸二氢钠0.3g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.01g/L，罐内装液体总体积为3.75L，装液系数为0.75；(3)米根霉无载体固定化细胞的培养调控上述米根霉孢子乳悬液，在温度为32℃、通气流量2.0L/(L·min)、搅拌转速为400转/min、且培养基中的钠与钾离子比例为1∶1条件下培养，培养至12小时的时候，菌丝球浓度约为103个/L；此时增加转速为800转/min，控制约105个孢子形成一个菌球体，菌球体密度接近104个/L；在第20小时至第24小时的培养过程中，无菌添加4.0g的甲基硅油材料，使其浓度为1.0g/L，促使形成菌球体的形状规则、大小较均一，菌球体的平均粒径控制在0.5mm至3.0mm的范围内，球体密度104个/L，且颗粒直径呈正态分布，制得适于反复发酵的米根霉无载体固定化细胞；(4)米根霉无载体固定化细胞的扩培将形状规则、粒径均一，平均粒径在0.5mm至3.0mm范围内的米根霉无载体固定化细胞从5L罐中无菌转接入50L罐内，装液系数均为0.75，50L罐的培养基与5L罐的培养基成分相同，在温度为32℃、转速至1200转/min、通气流量为3.0L/(L·min)条件下培养，在第12小时实现菌球体的更细与10倍的扩培，菌球体粒径均匀，呈正态分布，且密度约范围内，球体密度104个/L，制得50L适于规模化反复发酵的米根霉无载体固定化细胞。