[发明专利]一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法

摘要

一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，它属于基础生物学及医学领域。本发明解决了DNA残留，及菌体生长过程中管家基因表达不稳定和当PCR效率不高或多种基因间PCR效率差别较大时，所分析出的结果误差较大，致使现有基因表达相对定量在实际应用中具有一定局限性的问题。本发明的分析方法是将RNA提取物中的并存DNA作为内标，制备RT、RT^－样品，通过相对定量公式计算出原核生物基因表达量，其中Q表示目的基因的表达量，Q′表示参照基因的表达量，ΔCt＝Ct_RT－Ct_RT－，ΔCt′＝ Ct_RT′－Ct_RT－′，E＝10^[－1/slope]－1，Ct值是指荧光信号达到阈值时的循环数，RT表示反转录，RT^－表示非反转录。本发明具有过程简单、易操作、一次性可进行大量样品检测、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。

主权项

1.一种利用实时荧光反转录PCR分析原核生物基因表达的相对定量方法，其特征在于分析方法的步骤如下：一、利用被检测原核生物RNA为模板反转录获得的cDNA进行梯度稀释绘制出倍比稀释标准曲线，获得斜率slope，通过PCR效率公式E＝10[-1/slope]-1计算出Real-time PCR效率E；二、原核生物的总核酸的提取：利用酚-氯仿法提取处于对数生长中期的被检测原核生物的总核酸；三、对所提取的总核酸制备反转录样品和非反转录样品，制备方法如下：取两等份的经步骤二提取的被检测原核生物总核酸；将其中的一份进行反转录反应得到反转录样品；将另一份用体积浓度为0.1％的DEPC水稀释至与RT样品相同的浓度，获得非反转录样品；四、在步骤三得到的反转录样品和非反转录样品进行Real-time PCR检测，将步骤三中分别获得反转录样品的CtRT值和非反转录样品的CtRT-值；五、原核生物基因相对定量表达的分析：指定被检测原核生物中一组基因表达量Q′为参照组采用上述步骤测得的数据通过相对定量公式$Q_R=\frac{Q}{Q^{\prime }}=\frac{{(1+E)}^{-\mathrm{\Delta Ct}}-1}{{(1+E)}^{-\Delta {\mathrm{Ct}}^{\text{′}}}-1}$计算原核生物基因的相对表达量QR；其中Q表示目的基因的表达量，Q′表示参照基因的表达量，ΔCt＝CtRT-CtRT-，ΔCt′＝CtRT′-CtRT-′，E＝10[-1/slope]-1，Ct值是指荧光信号达到阈值时的循环数，RT表示反转录，RT-表示非反转录。