[发明专利]一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法

摘要

一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，它涉及一种分析微生物群落结构组成的方法。它解决了目前现有的生物检测和分析方法难以分析微生物群落的生物组成结构的问题。方法：一、提取微生物群落DNA；二、PCR扩增；三、酶切去除反意义链；四、凝胶电泳；五、纯化DNA；六、微生物群落的组成结构分析。本发明可以对工程系统内复杂的微生物群落进行群落结构分析，具有快速、准确的优点，可以解析群落演替，同步掌握工艺系统内微生物菌群变化情况，指导工艺、提高工程系统的运行效率。

主权项

1.一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法按以下步骤进行：一、采用周冀中等人的DNA提取方法提取微生物群落DNA；二、PCR扩增：PCR扩增正向引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，PCR扩增反向引物序列为TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5’端采用磷酸标记；三、酶切去除反意义链：酶切反应体系为50μL由5μL 10×buffer缓冲溶液、40μLPCR扩增产物和5μL浓度为5U/μL的λ核酸外切酶组成，酶切反应体系在37℃的环境中反应3～4h，然后纯化酶切产物，再溶解于20μL重蒸馏水中；四、将溶解于重蒸馏水中的酶切产物与等体积的变性剂混合置于95℃的环境中热变性处理10min，然后立即冰浴5min，之后凝胶电泳上样、在4～20℃、电压为250～300V的条件下电泳12～18h；五、将凝胶浸泡于重蒸馏水中10min，然后用灭菌的刀片将DNA条带分别切下放入离心管中并研碎，再向每支离心管中加入50μL裂解液在37℃的环境中处理3h，然后离心、分离上清液，并向上清液中加入上清液体积2倍的无水乙醇，置于-20℃的环境中沉淀2h，再在24000g、4℃的条件下离心15min，沉淀物DNA在37℃的环境中干燥15min后加入10μL TE溶液；六、对步骤五得到的沉淀物DNA分别进行分析，即得出微生物群落的组成结构；步骤四凝胶中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的10％～14％、甘油占凝胶总重量的5％～10％，其中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的质量比为49～55∶1；步骤四中变性剂由去离子甲酰胺和上样缓冲液组成，其中上样缓冲液由NaOH溶液、EDTA、溴酚蓝、二甲苯氰FF和去离子水组成，上样缓冲液中NaOH的浓度为10mM/L、EDTA的浓度为20mM/L、溴酚蓝的浓度为0.02％(重量)、二甲苯氰FF的浓度为0.02％(重量)，去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1∶3；步骤五中50μL的裂解液含有0.5M/L的乙酸铵、10mM/L的乙酸镁，1mM/L、pH值为8.0的EDTA、0.1％(重量)的SDS和余量的重蒸馏水。