[发明专利]棘皮动物活体取样提取DNA的方法

摘要

本发明公开一种棘皮动物活体取样提取DNA的方法，是取活体海胆的管足或取活体海参的管足、触手或肠，用加有DNA酶的裂解液裂解消化，经过萃取、离心取上清液、离心除渣(骨片)、乙醇沉淀、离心分离、检测等步骤，使所提取的DNA的浓度与质量，与棘皮动物传统的(死体)取样组织提取的DNA一致。无需将棘皮动物杀死，而是在活体上取样，继而提取DNA，使分子生物学技术能真正成为遗传育种的辅助工具。利用本发明，可以合理利用棘皮动物资源，进行辅助育种、养殖状况监测、基因筛选、家系鉴别等工作。另外，对于棘皮动物中很多濒危种的保护和研究，意义也十分重大。

主权项

1.一种棘皮动物活体取样提取DNA的方法，其步骤如下：a.取棘皮动物活体组织至少0.01g，放入离心管中；b.在盛有棘皮动物样品组织的离心管中，加入200μl裂解液，然后将组织在裂解液中充分剪碎，50℃消化45～55min，期间每隔10min振荡摇匀一次，所述裂解液的组分及终浓度为0.2g/l蛋白酶K，0.5％SDS，100mmol/l EDTA，0.05g/lRNA酶；c.在离心管中加入200μl TES稀释溶液稀释；d.加入200μl的Tris-饱和平衡酚和200μl氯仿-异戊醇混合液，萃取15～30min；e.7500r/min离心10min，用粗口枪头移液器抽取上清，将上清液置入另一离心管中；f.重复d、e步骤；g.将萃取之后的上清夜在10000r/min离心10min，使用粗口枪头移液器吸取溶液，放入另一离心管中；h.在离心管中，加入两倍于离心管中体积的100％的-20℃乙醇，之后放入-20℃中静置至少4h；i.12500r/min离心15min，除去溶液，将离心管倒置在滤纸上，吸干剩液；j.向离心管中加入70％乙醇800μl，洗涤一次，12500r/min离心5min，倒掉溶液，室温晾干至少30min；k.加入0.1×TE 100μl，轻轻振荡，然后4℃溶解至少4h；l.用1％的琼脂糖凝胶电泳，取2μl DNA模板混合2μl上样缓冲液在琼脂糖胶上点样进行检测。