[发明专利]一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法

摘要

一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法，本发明首先设计一种富集分离培养基，从河道底泥中分离出一种硝基苯优势降解细菌并进行纯化培养，其具体步骤为：1.配制富集分离培养基；2.富集分离培养；3.配制纯化培养基；4.纯化培养；5.配制扩大繁殖培养基；6.扩大增殖培养。本发明首次从河道底泥中筛选出对硝基苯具有特异降解能力的微球菌。该位球菌的筛选、分离、纯化和扩大培养方法简单、可靠，各培养基的组分易得、配制方便。利用所获微球菌直接降解河道底泥中的硝基苯，可缩短传统治理工艺流程、缩减成本，提高效率，为开发硝基苯污染河道底泥的原位微生物修复新技术提供了可能。

主权项

1.一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法，其特征是：本发明首先设计一种富集分离培养基，从河道底泥中分离出一种硝基苯优势降解细菌并进行纯化培养，其具体步骤如下：(1)、配制富集分离培养基：富集分离培养基由NaCl、K2SO4、MgSO4·7H2O、维生素B、硝基苯和水组成，pH为7.0-7.2，先准备5个三角瓶，分别标记为A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶，每个瓶都装等量的富集分离培养基，其中NaCl、K2SO4、MgSO4.7H2O和维生素B的含量是固定的，它们是(质量百分比)：0.5％NaCl，0.8％K2SO4，0.5％MgSO4·7H2O，0.01％维生素B，在A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶中，硝基苯的含量依次为(质量百分比)：0.5％、0.4％、0.3％、0.2％和0.1％，水的含量依次为(质量百分比)：97.69％、97.79％、97.89％、97.99％和98.09％，然后将富集分离培养基于111℃下湿热灭菌30min，冷却至常温备用；(2)、富集分离培养：首先，按照上述富集分离培养基质量的5％取河道底泥，接种到A瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养36h-48h；培养完成后，在A瓶内取5ml培养液，接种到B瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h-36h；培养完成后，在B瓶内取5ml培养液，接种到C瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h；培养完成后，在C瓶内取5ml培养液，接种到D瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h；培养完成后，在D瓶内取5ml培养液，接种到E瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h。这样便获得最终富集培养液；(3)、配制纯化培养基：其组分和含量为(质量百分比)：0.1％牛肉膏，0.5％葡萄糖，0.5％NaCl，0.8％K2SO4，0.5％MgSO4·7H2O，0.01％维生素B，0.1％硝基苯，1.5-2.0％琼脂，95.49％-95.99％水，pH＝7.0-7.2，于111℃下湿热灭菌30min，然后将纯化培养基分别倾倒入8个培养皿中，冷却至常温，使每个培养皿底部均形成均匀的薄层凝固层；(4)、纯化培养：a、取富集分离培养得到的最终富集培养液1ml接种到一个形成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中，置28℃-30℃恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基表面形成若干乳黄色菌苔；b、选取形态相同且数量居多数的菌苔，用接种环挑取微量，在另一个形成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中划线，置28℃-30℃恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基表面形成形态基本相同的菌苔；c、按上述b步骤重复操作6次，最终获得纯菌株，即对硝基苯具有特异降解能力的微球菌，于4℃保存；(5)、配制扩大繁殖培养基：其组分和含量为(质量百分比)0.2％-0.3％牛肉膏，0.5％-1.0％葡萄糖，0.4％-0.6％NaCl，0.6％-0.8％K2SO4，0.3％-0.6％MgSO4·7H2O，0.01％-0.03％维生素B，96.67％-97.99％水，pH＝7.0-7.2，置于三角瓶中，于111℃下湿热灭菌30min，冷却至常温备用；(6)、扩大增殖培养：a、在无菌条件下，取扩大繁殖培养基200ml置于三角瓶中；b、用接种环取两环微球菌菌苔，接种于盛有200ml扩大繁殖培养基的三角瓶中，于28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养36h-48h后，静置10min，待培养液中的浑浊物全部沉淀于三角瓶底部后，倒出三角瓶中50ml-100ml上层清液；c、在无菌条件下，向该三角瓶中补充与倒出上层清液等体积(50ml-100ml)的扩大繁殖培养基，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h后，所获培养液即为扩大增殖的微球菌菌液。