[发明专利]一种利用分子标记检测三系杂交水稻红莲型新型恢复基因的方法

摘要

本发明公开了一种利用分子标记检测三系杂交水稻红莲型新型恢复基因的方法，该方法包括下列步骤：首先是特定标记的引物设计，其次是DNA的微量提取；第三是标准PCR扩增体系的建立；第四是扩增的分子标记的检测分析；第五是新恢复基因的确定。本发明方法简便，操作方便，该方法以恢复基因共分离的分子标记为基础，快速、准确、可靠地通过实验室筛选水稻种质材料，使新型恢复系的选育具有强烈的目的性和针对性，提高了新型恢复系的选育效率。

主权项

1.一种利用分子标记检测三系杂交水稻红莲型新型恢复基因的方法，它包括下列步骤：A、共分离分子标记的PCR引物设计：M1引物：正向引物F1：5’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’反向引物R1：5’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’M2引物：正向引物F2：5’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’反向引物R2：5’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’；B、DNA的提取：(1)对每个待检测的水稻品种取一段长3-5cm、宽0.5-1cm，重0.1克的水稻嫩叶及0.2克粉末状石英沙，依次放入一1.5ml离心管中，然后在研磨仪上将叶片研磨成浆；(2)加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min，其间每隔5min振荡一次离心管；(3)水浴结束后，每个离心管中加入500μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀20min至颜色深褐色，离心机上10000rpm离心5min；(4)取上清300μl转移至另一1.5m1离心管，加入600μ1无水乙醇，-20℃，混匀，冰上放置20min，12000rpm离心15min；(5)倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精风干，然后加入30μl无菌水溶解DNA沉淀即可；C、PCR扩增体系的建立：标准的PCR扩增反应体系为15μl，组成如下：总DNA/50ng 1μl10×PCR buffer/pH8.3 1.5μl25mM MgCl2 0.6μl25μm dNTP 0.6μl0.6单位Taq酶 0.6μl5 pM的引物F 1μl5 pM的引物R 1μl去离子无菌水/ddH20 8.7μl反应混合物用矿物油覆盖，PCR反应程序如下：1 cycle： 94℃ 5min30 cycle：94℃ 1min；50℃ 1min；72℃ 1min1 cycle： 72℃ 5minstore：4℃；D、扩增DNA片段检测：(1)分别以含红莲恢复基因Rf5、Rf6的水稻品种密阳23和9311作对照，分别以Rf5、Rf6共分离的分子标记M1和M2进行PCR扩增，扩增产物均在3.0％的琼脂糖胶上电泳；(2)电泳电压为120V，时间1h，使扩增产物充分分开，然后在凝胶成像系统中观察电泳结果；(3)将每个品种扩增的带型分别与密阳23中Rf5和9311中Rf6共分离的分子标记M1和M2带型进行比较：一个水稻品种分子标记的带型与红莲型恢复基因Rf5、Rf6带型不同，确定该水稻品种携带一个与已知的红莲Rf5、Rf6不同的新恢复基因，将其确定为新恢复基因的候选材料；E、红莲型细胞质雄性不育新恢复基因位点的确定：(1)以红莲不育系粤泰A作为测试对照，抽穗时选择每个待测材料分别与两个不育系与候选水稻材料测交，并套袋，杂交25天后即收种，50℃烘烤3天，打破休眠；(2)将杂交种子在30℃下浸泡12h，然后露水用湿布包裹，30℃下保温12h，然后在30℃下浸泡12h，继续露水用湿布包裹，37℃下保温12h催芽，芽长0.5cm，播种，秧苗30天移栽，直到抽穗；(3)抽穗时，用1％KI-I2染色考察每个杂交组合的花粉育性，即每个组合在抽穗时取当天即将开放的颖花，挑出花药，挤出花粉，然后在显微镜下观察，深黑色的为可育花粉，其他的为不育花粉；(4)当测交组合F1花粉育性在30％、套袋结实率在20％，其所对应的水稻父本，即确定为含恢复基因；(5)新恢复基因的验证：将含红莲型恢复基因的候选恢复系R’与对照品种杂交，配制杂种F1，即Rf5：R’/密阳23；Rf6：R’/9311；然后以红莲不育系粤泰A作母本与相应的杂种F1测交，将测交组合(A//R’/密阳23，A//R’/9311)种植300株的群体，观察育性分离，群体中出现不育株，候选恢复系R’的恢复基因与对照品种恢复系的恢复基因不等位，候选恢复系R’含新的红莲恢复基因。