[发明专利]从分子改良木霉菌分离可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方法

摘要

本发明涉及一种从分子改良木霉菌分离可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方法，利用限制性内切酶介导的基因整合技术，通过制备木霉菌菌株原生质体及进行质粒提取，构建木霉菌转化子，继而将转化子培养、发酵，并从发酵液中筛选出具有系统诱导黄瓜抗白粉病的木霉转化子胞外代谢物。本发明的木霉菌转化子胞外代谢物能克服活体木霉菌诱导抗性效果不稳定的缺点，不仅对白粉病具有较明显的防治效果，还能促进黄瓜幼苗的生长，为绿色分子农药创制提供了一种从木霉菌快速、高效筛选新型微生物源农药先导化合物的有效方法。

主权项

1.一种从分子改良木霉菌分离可诱导黄瓜抗白粉病代谢物的方法，其特征在于包括如下步骤：1)配制浓度为13-13.5毫克/毫升的细胞壁裂解酶溶液用于处理木霉菌菌丝，菌丝在细胞壁裂解酶溶液中的比例为30-40％；在26-28℃条件下振荡培养3-4小时，获得原生质体；然后过滤，用0.7MNaCl溶液冲洗，4℃下离心，收集原生质体；再用山梨糖醇缓冲液冲洗，4℃下离心，重悬原生质体于山梨糖醇缓冲液中，调节原生质体浓度至1-1.5×107个/毫升；2)取培养至对数生长期的细菌培养液1.5-2毫升，置于离心管中离心沉淀，用100微升含有50-55毫摩尔/升葡萄糖、10.0-11.0毫摩尔/升乙二胺四乙酸、20-25毫摩尔/升Tris HCl的溶液悬浮，冰浴5-10分钟，再加入200微升含有200-250毫摩尔/升NaOH和1％SDS的溶液，置冰浴5分钟后，再加入150微升3-4摩尔/升醋酸钾，混匀，冰浴5-10分钟；向离心管中加入与管内液体等体积的酚氯仿异戊醇的混合物，混合物中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；离心取上清，加入2倍于上清体积的预冷无水乙醇，-20℃放置30分钟，离心，将沉淀溶于无菌去离子水或含10毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、0.1毫摩尔/升乙二胺四乙酸、pH8.0的TF溶液中，加入RNase A，去除RNA，提取到质粒DNA；3)取质粒DNA 38-42微克、10个单位/微升的限制性内切酶HindIII10微升、山梨醇缓冲液200微升，配制成酶-质粒混合液；将100微升原生质体悬浮液与酶-质粒混合液混匀后，缓慢加入2毫升聚乙二醇，加入5毫升预冷的山梨醇缓冲液，4℃下离心，弃上清，加入3毫升再生培养基，室温下放置5.5-6小时；分别在含300微克/毫升和250微克/毫升潮霉素的培养基进行二次筛选，并经PCR和转膜印迹检测，获得木霉菌转化子，在4℃冰箱中保存；4)将木霉菌转化子接种于PDA固体培养基上，25℃下培养6-8天，用无菌蒸馏水将孢子洗下，并配成浓度为3×107个孢子/毫升的孢子悬浮液，在PDB液体培养基内140-150转/分、28℃的条件下发酵3-5天，获木霉菌转化子胞外代谢物发酵液；5)取木霉菌转化子胞外代谢物发酵液对黄瓜幼苗进行浸种或灌根处理，处理2-3天后将白粉病菌分生孢子均匀接种到黄瓜幼苗的第一片真叶上，发病后调查病情指数，筛选出具有诱导抗性的木霉菌转化子胞外代谢物。