[发明专利]猪防御素酵母工程菌的制备方法

摘要

本发明公开了一种猪防御素酵母工程菌的制备方法，首先利用基因定点突变的方法对猪防御素基因进行改造，筛选出生物活性高的猪防御素基因的突变体，然后利用酵母菌惯用的密码子人工合成密码子优化的猪防御素基因，通过同源重组将该防御素基因以多拷贝形式整合到酵母染色体中，经过多次筛选得到产量高、生物活性强的生产猪防御素的酵母工程菌。防御素酵母工程菌发酵后通过加热杀死酵母菌后，通过浓缩可直接作为饲料添加剂，而不需要经过任何分离提取过程，降低了防御素的生产成本，提高了生产企业的经济效益。本发明为大规模工业化生产猪防御素和解决猪饲料抗生素添加剂的替代创造了条件。

主权项

1、猪防御素酵母工程菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)猪β-防御素-2基因的改造通过RT-PCR方法从猪白细胞中扩增猪防御素基因，并将其克隆到真核生物表达载体pcDNA3.1上，构建成真核表达载体；利用定点突变方法，对猪防御素基因进行定点突变，得到若干突变体，在培养的293T细胞表达突变体基因，从培养基中纯化表达产物—猪防御素，通过抑菌试验鉴定不同防御素突变体的活性，从中筛选出抗菌活性高的突变体基因；(2)猪防御素基因的合成根据上述筛选出的防御素基因的突变体氨基酸序列和酵母惯用的密码子设计基因序列，合成带有两个酶切位点(SnaBI和NotI)、无信号肽的防御素基因，基因序列如下：ggctacgtaATTAATTTTTTGACTGGTATTGGTCAAAGATCTGATCATTATAATTGTGTTAGAAAAGGTGGTACTTGTAATTATTCTGCTTGTCCATTGTTTAATAAAATTGATGGTACTTGTTATAGAGGTAAAGCTAAATGTTGTTTGAGATGAgcggccgcggc氨基酸序列为：INFLTGIGQRSDHYNCVRKGGTCNYSACPLFNKIDGTCYRGKAKCCLR(3)高效表达猪防御素酵母工程菌的制备首先将合成的猪防御素基因克隆到酵母表达载体pPIC9K的SnaBI和NotI位点上，构建成pPIC9K/pBDF表达载体，用SalI酶切pPIC9K/pBDF表达载体使其线性化，利用电转移方法将线性化的表达载体转化到酵母体内，使其与酵母染色体进行同源重组，通过筛选His+重组体和用G418加压筛选多拷贝重组体，得到高表达猪防御素基因的猪防御素酵母工程菌。