[发明专利]一种提取聚唾液酸的方法

摘要

一种提取聚唾液酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明以一株产聚唾液酸大肠杆菌的发酵液为原料，经过过滤去除菌体，上清液加入适量氯化钠和乙醇等溶剂沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，再用过滤去除变性蛋白质，滤液经过碱性蛋白酶处理、氯代十六烷基吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)络合沉淀并解离后，再用过量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超纯水溶解，用层析柱进行分级纯化，收集洗脱液经过透析，冷冻干燥得聚唾液酸产品。本发明提出一种有效的聚唾液酸分离纯化方法，得到97％以上纯度的聚唾液酸产品，以用做药品和化妆品的原料。

主权项

1.一种提取聚唾液酸的方法，其特征是以一株大肠杆菌(Escherichia coli)K235-JY II-74的发酵液为原料，经过板框过滤去除菌体，上清液加入氯化钠和乙醇溶剂沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，再用板框过滤或者硅藻土过滤去除变性蛋白质，滤液经过碱性蛋白酶处理、氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵络合沉淀并解离后，再用乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超纯水溶解，通过层析柱进行分级纯化，收集洗脱液经过透析，冷冻干燥得聚唾液酸产品；各步骤工艺条件为：(1)过滤：发酵液中加入10～20g/L的80～200目的珍珠岩助滤剂，发酵液经过板框过滤去除菌体，过滤方式选择110目工业滤布；(2)沉淀：过滤去除菌体后的清液加入氯化钠，使氯化钠质量浓度达2％～5％，溶解后再加入2～4倍体积的95％质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75％质量浓度的乙醇洗涤2～4次；(3)溶解、过滤：聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，加入10～20g/L的80～200目的珍珠岩助滤剂，通过板框过滤或者硅藻土过滤机进行过滤，通过过滤去除部分变性蛋白质；(4)酶处理：过滤去除部分变性蛋白后的滤液加入碱性蛋白酶进行处理，其工艺为：碱性蛋白酶活力2～5万U/mL，pH 7～8，加量为10mL/kg聚唾液酸，30～70℃酶解3～7小时；(5)络合沉淀：酶处理过的聚唾液酸溶液加入过量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵进行络合沉淀，氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵加量为1～3g/g聚唾液酸，温度为10～15℃；(6)解离：经过络合得到的聚唾液酸沉淀加入2～4倍量0.5～0.8M的氯化钠溶液，40～60℃水浴解离3～8小时；(7)乙醇沉淀：解离后的溶液再加入2～4倍体积的95％质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75％质量浓度的乙醇洗涤2～4次；(8)溶解、柱层析：乙醇沉淀出的聚唾液酸用超纯水溶解后进行层析分离，其工艺为：层析柱填料为DEAE-纤维素或者葡聚糖凝胶，层析柱用0.01～0.05M磷酸盐缓冲液进行平衡，洗脱液为0.02～0.08M氯化钠溶液，洗脱速度为1～5mL/min，分别收集分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸；(9)透析：层析收集得到的分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸分别用截留分子量为7000Da、12000～14000Da透析膜进行透析48～72小时；(10)冷冻干燥：两种透析液体分别经冷冻干燥得到两种规格的聚唾液酸产品。