[发明专利]人血浆DNA中APC基因甲基化定量检测方法

摘要

本发明涉及一种对人血浆DNA中APC基因甲基化定量检测方法。本发明取静脉血后得血浆，制备血浆DNA标准曲线样品，提取待测血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA，对血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA化学修饰，对人APC基因启动子区中1A序列的707号CpG位点设计特异性引物和Taqman荧光探针，扩增后以标准品血浆DNA的扩增结果制定标准曲线，对待测样本进行甲基化定量结果分析。本发明解决了血浆中DNA含量少、丢失率高、DNA降解、带有致癌污染物等缺陷。本发明利用针对APC启动子区1A序列一对引物和一个Taqman荧光探针，针对性检测APC基因启动子部位第707号位的甲基化高发CpG位点，进行定量分析，可用于肿瘤患者的治疗疗效观察、预后和复发监测等方面。

主权项

1.人血浆DNA中APC基因甲基化定量检测方法，其步骤在于：(1)取人外周静脉血，EDTA-K2抗凝，离心后取血浆；(2)制备血浆DNA标准曲线样品；(3)采用磁珠法微量核酸提取技术提取血浆DNA、标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA；(4)采用亚硫酸氢盐法对血浆DNA进行化学修饰，同时修饰标准曲线血浆样品DNA和健康人血浆DNA，分别作为阳性和阴性对照；(5)针对人APC基因启动子区中707CpG位点设计特异性引物和Taqman荧光探针：上游引物序列：APCMS707 5′-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3′，大小为21bp，分子量为6.99KD下游引物序列：APCMA7075′-CCGACCCGCACTCCG-3′，大小为15bp，分子量为5.00KD荧光探针序列：APCMP7075′-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE-3′，大小为20bp，分子量为6.66KD，5′端标记为JOE，3′端标记为ECLIPSE目的产物大小为97bp，分子量为64.60KD；(6)25μl的荧光定量MSP扩增体系的组成为：H2O 11.9μl，5×Real Time PCR Buffer5μl，10mM的dNTPs 1.0μl，250mM的MgCl2 0.4μl，5mM的上下游引物各1.0μl，5mM荧光探针的0.5μl，热启动酶0.2μl，样本模板投入量为4μl；(7)荧光定量MSP扩增的反应条件如下：①95℃ 5min；②94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，共55个循环；(8)以标准品血浆DNA的扩增结果制定标准曲线，对待测样本进行定量结果分析。