[发明专利]葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法

摘要

本发明涉及具有葡聚糖酶例如，内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶活性或这些活性的组合的多肽，和编码所述多肽的多核苷酸。在一方面，所述葡聚糖酶活性是内切葡聚糖酶活性(例如，内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)，并且包括水解在纤维素、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1，4-β-D-糖苷键，在混和的β-1，3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木质素葡聚糖和包含纤维素部分的其它植物材料中的β-1，4键。此外，还提供了设计新型酶的方法和使用它们的方法。在可选的方面，所述新型葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶在升高的或降低的pH和温度下具有增加的活性和稳定性，包括耐热性或热稳定性。

主权项

1.分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包含：(a)，(i)与如下核酸序列在至少大约20、30、40、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200或225或更多个残基的区域内，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22，或(ii)在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列，并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在0.2×SSC中在大约65℃的温度洗涤大约15分钟，其中任选地，所述核酸的长度是至少大约20、30、40、50、60、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个残基，或基因的全长或转录体的全长；其中，(i)或(ii)所述的核酸编码至少一种具有葡聚糖酶活性的多肽，或编码这样的多肽或肽，所述多肽或肽能够产生与具有下列序列的多肽特异性结合的抗体：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23，并且，(i)或(ii)所述的核酸序列包含至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多种或所有下列基于SEQ ID NO：1的序列的核苷酸残基变化：在位置4至6的核苷酸是AAT或AAC，在位置37至39的核苷酸是AAT或AAC，在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，在位置169至171的核苷酸是GAT或GAC，在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置181至183的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置184至186的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，在位置187至189的核苷酸是CAT或CAC，在位置187至189的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置205至207的核苷酸是CAT或CAC，在位置205至207的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置205至207的核苷酸是TAT或TAC，在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置211至213的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置211至213的核苷酸是GAA或GAG，在位置211至213的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置211至213的核苷酸是CAA或CAG，在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置211至213的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，在位置220至222的核苷酸是GAA或GAG，在位置220至222的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，在位置220至222的核苷酸是ATG，在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，在位置301至303的核苷酸是TAT或TAC，在位置307至309的核苷酸是TGT或TGC，在位置307至309的核苷酸是CAA或CAG，在位置316至318的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，在位置325至327的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，在位置346至348的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置346至348的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置388至390的核苷酸是TAT或TAC，在位置391至393的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，在位置442至444的核苷酸是CAT或CAC，在位置484至486的核苷酸是CAA或CAG，在位置496至498的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置547至549的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置556至558的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置556至558的核苷酸是GAT或GAC，在位置556至558的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置556至558的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置571至573的核苷酸是TGT或TGC，在位置571至573的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，在位置601至603的核苷酸是ATT、ATC或ATA，在位置601至603的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置601至603的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置646至648的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置688至690的核苷酸是AAA或AAG，在位置688至690的核苷酸是CAA或CAG，在位置688至690的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，在位置691至693的核苷酸是ATG，在位置691至693的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置700至702的核苷酸是GAT或GAC，在位置736至738的核苷酸是CAA或CAG，在位置736至738的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置772至774的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置772至774的核苷酸是TAT或TAC，在位置784至786的核苷酸是CAT或CAC，在位置784至786的核苷酸是ATG，在位置784至786的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置784至786的核苷酸是CAA或CAG，在位置808至810的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置811至813的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置826至828的核苷酸是TGT或TGC，在位置826至828的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置829至831的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，在位置868至870的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置889至891的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置892至894的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置892至894的核苷酸是AAT或AAC，在位置892至894的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置892至894的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置892至894的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置898至900的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG，在位置913至915的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置934至936的核苷酸是ATT、ATC或ATA，和/或在位置943至945的核苷酸是ATT、ATC或ATA；并且任选地，所述序列同一性通过运用序列比较算法的分析或通过视觉检查来确定，并且任选地所述序列比较算法是BLAST版本2.2.2算法，其中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d“nr pataa”-F F，并且所有其它选项被设置为默认值；(b)，(a)所述的核酸(多核苷酸)序列，其编码具有葡聚糖酶活性但是缺乏信号序列或前原蛋白序列或同源启动子序列的多肽；(c)，(a)或(b)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有葡聚糖酶活性并且进一步包括异源氨基酸序列的多肽，或(a)或(b)所述的核酸(多核苷酸)，其包括异源的核苷酸序列；(d)，(c)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源氨基酸序列包含编码异源(前导)信号序列或标记物或表位的序列，或由编码异源(前导)信号序列或标记物或表位的序列组成，或者所述异源核苷酸序列包含异源的启动子序列；(e)，(c)或(d)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源的核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，所述异源(前导)信号序列包括N-端和/或C-端突出端，或由之组成，用于靶向内质网(ER)或内膜，或靶向玉米内质网(ER)或内膜系统，或者所述异源的序列编码限制性位点；(f)，(d)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源的启动子序列包括组成型或诱导型启动子、细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或玉米特异性启动子，或由之组成；(g)，(a)到(f)的任一项所述的核酸(多核苷酸)，其中所述葡聚糖酶活性包括：内切葡聚糖酶活性；催化内切1，4-β-D-糖苷键或内部的β-1，3-糖苷键的水解，水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖以产生较小分子量的多糖或寡聚体；内切-β-1，4-内切葡聚糖酶活性；1，4-β-D-糖苷键活性，包括水解纤维素、纤维素衍生物、地衣聚糖或谷物、或包括羧甲基纤维素或羟乙基纤维素的纤维素衍生物、或包括β-D-葡聚糖或木葡聚糖的谷物中的1，4-β-D-糖苷键；水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃型葡萄糖的多糖；水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素；水解在木材或纸浆或木材或纸品中的纤维素或半纤维素；催化在饲料、食品或饮料、或包含基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、面团、水果或蔬菜的饲料、食品或饮料中的葡聚糖的水解；催化在微生物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖的水解；(h)，(a)到(g)的任一项所述的核酸(多核苷酸)，其中所述葡聚糖酶活性是热稳定的，或所述多肽在包含如下温度范围的条件下保持葡聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高的温度；或(i)，(a)到(g)的任一项所述的核酸(多核苷酸)，其中所述葡聚糖酶活性是耐热的，或所述多肽在暴露于如下范围内的温度之后保持葡聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高的温度；(j)，(h)或(i)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述多肽在如下酸性pH下是耐热的或热活性的：约pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0或更低pH，或所述多肽在如下pH下是耐热的或热活性的：约pH7.0、pH7.5、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0或更高pH；(k)，(a)到(j)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中在隐蔽性转录起始位点中的核苷酸残基被修饰以除去大多数或所有截短的转录体的产生；(l)，(k)所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中在隐蔽性转录起始位点中的所述核苷酸残基的修饰包括核糖体结合位点(RBS)的改变；(m)，(k)或(l)所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中在隐蔽性转录起始位点中的所述核苷酸残基的修饰包括在SEQ ID NO：3的残基77到106中的下列修饰：ATGAGGGCGACTGGGGAGTCGTGATAAAAG；或等价物；或(n)，与(a)到(n)的任一项所述的核苷酸序列完全互补的核酸序列。