[发明专利]欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法

摘要

本发明提供一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，该方法是针对PRRSV VR－2332株的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX－6P－1－N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的氨基酸序列，建立针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30－N，重组质粒在大肠杆菌中成功表达，利用表达纯化的北美洲型N蛋白，制备用于PRRS抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒，该抗体试剂盒与IDEXX试剂盒的符合率均可达到90％，以纯化的欧洲型蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法，为PRRS抗体分型检测打下基础。

主权项

1、欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：1)目的蛋白的表达及纯化：针对PRRSV VR-2332的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用表达纯化的蛋白为抗原，建立欧洲型PRRS抗体试剂盒和美洲型PRRS抗体试剂盒；2)欧、美型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立：利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV N蛋白分别建立间接ELISA方法，确定美洲型N蛋白抗原包被浓度为4.5μg/mL，欧洲型N蛋白抗原包被浓度为8μg/mL；抗原包被条件均为37℃1h加4℃包被过夜；血清的稀释度均为1∶40，30min作为美洲型N蛋白包被时血清的工作时间，60min作为欧洲型N蛋白包被时血清的工作时间；使用1％的BSA封闭，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度均为1∶1000，结合时间均为30min。