[发明专利]一种分离纯化糖肽的方法

摘要

本发明一种用磁性微粒分离纯化糖肽的方法。其实现步骤为：用水清洗环氧化磁粒置于烧瓶中，将盛有悬浮液的烧瓶放到磁性分离器上进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；加入50毫升质量分数为5％的水合肼，将烧瓶置于水浴锅中，向烧瓶中插入搅拌器，充分混合、反应，反应完成后，用无水乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；将蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中，加入高碘酸钠至其最终浓度，常温避光反应；用G-25除盐柱除掉未反应的高碘酸钠；再用糖蛋白偶联，酶解得到糖肽。本发明优化了糖蛋白与肼功能化磁粒或的酰肼功能化磁粒偶联条件，分离纯化反应快速、高效。

主权项

1. 一种分离纯化糖肽的方法，其特征在于：包括下述步骤(1)制备肼功能化磁粒a 清洗取200毫克环氧化磁粒置于烧瓶中，用水清洗，清洗后将盛有悬浮液的烧瓶放到磁性分离器上进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；b 反应修饰向烧瓶中加入50毫升质量分数为5％的水合肼，将烧瓶置于水浴锅中，向烧瓶中插入搅拌器，再开启搅拌器搅拌使磁粒和水合肼充分混合、反应，将环氧化磁粒修饰成肼功能化磁粒；(2)糖肽的分离纯化a 清洗反应完成后，将肼功能化磁粒用无水乙醇和水分别清洗，进行磁性分离，去掉上层不含磁粒的清液；再用40毫升水重悬，重悬后将悬液保存备用；b 糖蛋白氧化将一定量的蛋白样品溶解或稀释于偶联缓冲液中，加入高碘酸钠至其最终浓度10～15毫摩尔，常温避光反应0.5～1.5小时；c 除高碘酸钠用G-25除盐柱除掉未反应的高碘酸钠；d 糖蛋白偶联将除盐后的蛋白溶液加入到经偶联缓冲液预处理过的肼功能化磁粒中，室温振荡偶联4～24小时，偶联后磁性分离，去上清；用清洗液洗磁粒3～6次，以除去未共价结合的蛋白；e 酶解得到糖肽磁粒上的糖蛋白用5毫摩尔pH为7.8的三羧乙基磷溶于0.1摩尔的碳酸氢氨的溶液中室温还原20分钟以上；然后加入碘代乙酰胺至其最终浓度为8～15mM，室温继续反应30分钟以上，磁性分离，去上清；用pH为7.8的碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入胰蛋白酶至其最终浓度20毫克/升，37℃振荡酶解4小时，补加相同量的胰蛋白酶，继续酶解10小时以上；f 清洗磁粒用2摩尔/升氯化钠和无水乙醇先分别清洗，再用pH为7.8的0.1摩尔/升碳酸氢氨溶液洗，直至非糖基化多肽完全去除；e 释放糖肽用pH为7. 8的0.1摩尔/升碳酸氢氨溶液重悬磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F，37℃振荡酶解4小时，添加相同量的糖肽酶F，继续反应4小时以上，完成糖肽的释放。