[发明专利]快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法

摘要

快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，是一种基于检测酶反应产物在电极表面产生的氧化信号来定性检测周围神经束中乙酰胆碱酯酶的电化学检测方法。它首先采用聚合物-金纳米粒子复合物修饰电极，然后依次在胆碱氧化酶和乙酰胆碱酯酶溶液中孵育，通过复合物膜对蛋白质良好的吸附力，使两种酶在电极表面富集，通过三电极系统，基于双酶体系测定底物乙酰胆碱的安培响应，从而间接实现对乙酰胆碱酯酶的检测(检测浓度范围：1.0－2.0unit/mL)。用神经组织匀浆代替标准乙酰胆碱酯酶溶液进行孵育，通过对乙酰胆碱是否有响应的检测，实现了对运动束和感觉束的快速鉴别，是一种在临床鉴别周围神经束性质领域的突破。

主权项

1.一种快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，它由下列步骤组成：步骤1.将金电极在碳化硅细砂纸上打磨，再分别用加0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液的麂皮抛光成“镜面”，最后经乙醇、二次水超声清洗，备用，步骤2.将金电极固定在旋转涂布仪中，表面朝上，将0.1mL以质量比例为7∶10∶1混合好的20％重均分子量为100000-20000的聚二甲基二烯丙基胺水溶液，重均分子量为60000的聚二甲基硅氧烷和Si-H官能交联剂的固化剂滴涂在电极表面，启动旋转涂布仪，在2000转/分的速率下旋转15分钟，随后在80℃烘箱中静置一个小时，使电极表面聚合物薄膜固化，步骤3.将步骤2修饰了聚合物薄膜的金电极浸入盛有0.5％氯金酸溶液的烧杯中，4℃下静置8小时，通过固化剂中Si-H键的还原作用，使金纳米粒子还原沉积在聚合物薄膜表面，步骤4.将步骤2修饰了聚合物-金纳米粒子复合膜的金电极浸入盛有2unit/mL的标准胆碱氧化酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过金纳米粒子良好的生物相容性，使胆碱氧化酶富集在电极表面，步骤5.将步骤4修饰好的金电极浸入盛有2unit/mL的标准乙酰胆碱酯酶溶液的eppendorf离心管中，静置10min，通过聚合物薄膜对乙酰胆碱酯酶的吸附性和金纳米粒子良好的生物相容性，使乙酰胆碱酯酶富集在电极表面，步骤6.将步骤5修饰好的金电极(4)取出，与参比电极(5)，对电极(6)共同插入检测池(2)中，加入2mL 0.1M pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将各电极连接在所用的电化学工作站(7)上，电化学工作站(7)与计算机(8)相连，步骤7.在电化学工作站的技术选项中选择安培电流-时间曲线法，电位设置在0.7V，运行电化学工作站进行扫描，待基线平稳后，加入2μL 0.2M/L氯化乙酰胆碱标准溶液，通过计算机监测其电化学响应，步骤8.分别用不同标准浓度的乙酰胆碱酯酶溶液重复上述4，5和7步骤，采用origin作图，步骤9.将神经根新鲜的标本分别装入标本瓶中，迅速放在液氮中保存备用，取用时在室温下自然解冻，解冻后保存在湿盒中，防止标本干燥脱水，步骤10.将步骤9中得到神经标本浸入0.05M 1mL pH7.4磷酸盐缓冲溶液，在组织匀浆器中打碎。然后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取上清液加入硫酸铵至25％饱和度。之后在10000转/分钟，4℃条件下离心15min，取下层沉淀，加入100μL二次蒸馏水溶解沉淀，步骤11.用步骤10制备得到的神经匀浆代替乙酰胆碱酯酶标准溶液，重复步骤5、6和7，通过电极对氯化乙酰胆碱的响应来判断神经匀浆中是否含有乙酰胆碱酯酶，从而进一步鉴别周围神经束的性质。