[发明专利]黄瓜游离小孢子的培养方法

摘要

本发明是一种黄瓜游离小孢子培养的方法，属于生物技术领域。包括取花蕾，鉴定小孢子发育时期，预处理，花蕾消毒，用B₅－13提取液采用挤压法游离小孢子，用76μm细胞筛过滤，离心，纯化小孢子，在25℃下进行静止暗培养至产生肉眼可见的胚状体，之后60r·min^－1振荡暗培养形成子叶形胚，在MS－BA胚状体萌发培养基上形成再生植株或无根苗，最后在生根培养基MS－IBA上诱导生根获得完整的再生植株。本发明可以获得单倍体或双单倍体。双单倍体既是良好的育种材料，可用于新品种的选育或品种改良，大大缩短育种年限，提高选择效率；也是进行AFLP、RFLP和RAPD等分子标记和遗传图谱绘制研究和进行物种进化研究、遗传分析、植物基因克隆筛选等的理想材料。

主权项

1、黄瓜游离小孢子的培养方法，包含下列步骤：1)取样在盛花期于晴天上午9:00～10:00从健壮植株上取花蕾，将花药从花蕾中剥出，置于载玻片上，滴几滴去离子水浸没花药，用镊子轻轧花药使小孢子游离出来，去除残留的花药组织，盖上盖玻片，在OLYMPUS显微镜下观察，选取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾用于游离小孢子培养，将花蕾置于4℃下预处理2d；2)花蕾消毒将花蕾先在75％酒精溶液里浸30s，然后用0.1％升汞消毒8min，最后用无菌水冲洗3次，每次30～60s；3)游离、纯化小孢子将消毒后的花蕾置于10mL离心管中，加入4～5mL配方为B5+质量比13％蔗糖，pH为5.8，用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌的B5-13提取液，用玻璃棒挤压花蕾使小孢子释放出来；使用孔径为76μm的细胞筛过滤；滤液在600r·min-1 的转速下离心5min，重复离心3次，至上清无色透明；弃上清，用配方为NLN+0.5mg·L-1 2，4-D+0.2mg·L-16-BA+质量比13％蔗糖，pH为5.8，用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌的液体培养基悬浮小孢子；最后使用血球计数板计数，调整小孢子密度约为1.0×105个·mL-1；4)胚状体诱导用直径60mm的培养皿分装小孢子悬浮液，每皿2mL，用Parafilm封口膜封口后，在25℃下进行静止暗培养至产生肉眼可见的胚状体，之后进行60r·min-1 振荡暗培养至形成子叶形胚；5)胚状体萌发将子叶形胚转移至配方为MS+0.2mg·L-1 6-BA+质量比3％蔗糖+质量比0.8％琼脂，pH为5.8，在121℃下高压灭菌20分钟的MS-BA胚状体萌发培养基上，在25℃、4000LX、16h·d-1下光照培养，20～25d后形成无根苗或根较弱的再生植株；6)诱导生根与植株再生将无根苗以及根较弱的再生植株转接至配方为MS+0.2mg·L-1IBA+质量比3％蔗糖+质量比0.8％琼脂，pH为5.8，在121℃下高压灭菌20分钟的生根培养基上，在25℃、4000LX、16h·d-1下进行光照培养，10d后即获得完整的再生植株。