[发明专利]表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子

摘要

本发明涉及表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子的构建及应用，属于基因工程疫苗领域。将猪细小病毒(PPV)VP2基因的C端基因片段克隆于人5型腺病毒穿梭载体，获得重组腺病毒rAd－ΔVP2，ΔVP2蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子[PPV:VLPs]。以PPV VP2病毒样粒子作为抗原转运载体，将2型猪圆环病毒(PCV2)核衣壳蛋白(Cap)的165－200位氨基酸(ΔCap)基因嵌合在PPV VP2的N端(ΔVP2)，获得重组腺病毒rAd－ΔCap－ΔVP2。嵌合的VP2(ΔCap－ΔVP2)蛋白成功的高效表达，并能自我装配成病毒样粒子[PPV:VLP(PCV2)]。本发明还涉及该重组病毒及其表达Cap基因的重组PPV VP2病毒样粒子在疫苗免疫等方面的应用。

主权项

1、表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子，其特征在于，是由以下方法构建而成：1)获取ΔCap-ΔVP2目的基因并克隆入pMD19-T载体以GenBank中PCV2-js2002基因登录号为AY691679和猪细小病毒PPV VP2重组质粒的基因序列为模板，用软件Primer 5.0设计引物：P3，P4，P5，P6和P7，分别加入酶切位点：P35′-ctggtaccatggtccaccgcccaggag-3′KpnIP45′-cagctagccgttaccgctggagaagg-3′NheIP55′-gagctagcgggggggttggtgtgt-3′NheIP65′-cggctgcagctagtataattttcttgg-3′PstIP75′-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3′NotI以P3，P4引物扩增PCV2Cap蛋白的165-200位氨基酸基因108bp的片段ΔCap，以P5，P6引物扩增PPV VP2蛋白C端1640bp的片段ΔVP2，扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与pMD19-T Vector连接，转化E.coli DH5α，碱裂解法提取质粒，分别用KpnI/NheI和NheI/PstI双酶切鉴定，获得阳性质粒pTΔCap和pTΔVP2。利用引物上的内切酶NheI和pMD19-TVector上的PstI将阳性质粒pTΔCap双酶切，回收2.8Kb的片段，同时利用引物上的内切酶NheI和PstI将阳性质粒pTΔVP2双酶切，回收1.64Kb的小片段，然后将回收的两片段用T4DNA Ligase连接，转化E.coli DH5α，碱裂解法提取质粒，KpnI/PstI双酶切鉴定，阳性质粒命名为pTΔCap-ΔVP2。2)重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2的构建与鉴定以P3，P7为引物，阳性质粒pTΔCap-ΔVP2为模板，PCR扩增ΔCap-ΔVP2片段，并引入内切酶Kpn I/NotI，按照pAdEasyTM载体系统操作说明，利用双酶切位点KpnI/NotI将外源片段ΔCap-ΔVP2克隆至转移载体pShuttle-CMV中；用PCR、KpnI/NotI双酶切及测序分析进行鉴定，命名为rShuttle-ΔCap-ΔVP2；3)表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子的获得用Pme I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与骨架载体pAdEasyTMVector在1.8kV、25μF和200Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使rShuttle-ΔCap-ΔVP2与pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH5α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，命名为pAd-ΔCap-ΔVP2。将重组质粒pAd-ΔCap-ΔVP2转染转染HEK-293A细胞，获得重组病毒rAd-ΔCap-ΔVP2；重组腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2表达ΔCap-ΔVP2嵌合蛋白在该重组腺病毒感染的293A细胞中自我装配成病毒样粒子PPV:VLP(PCV2)，即为获得的表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子。