[发明专利]一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法

摘要

本发明公开了一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)香蕉病叶总核酸的提取；(2)RT-PCR扩增和(3)电泳分析。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种方法简单，只需通过一次检测就能同时检测出香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒，有效减少样品交叉污染，检测效率高且准确的检测方法。

主权项

1、一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、香蕉病叶总核酸的提取：a、分别剪取感染BBTV、CMV和复合感染BBTV及CMV的香蕉病株幼叶0.1g；b、在液氮(-196℃)下研磨成粉末状，迅速加入900μL经过65℃预热的CTAB抽提缓冲液，转入2mL的离心管中，65℃水浴30min，期间不时摇匀；c、加入900μLl氯仿/异戊醇(V∶V/24∶1)，温和地摇匀，室温下用小型台式离心机12000rpm离心8min；d、将上清液转到新的2mL离心管中，加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2)和2.5×体积冰冷的无水乙醇，-20℃放置2hr，然后在4℃下12000rpm离心10min；e、弃上清液，用400μL无RNase的70％的乙醇将RNA振荡悬浮，使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解，再次离心10min以沉淀RNA，小心倒掉上清液，随后快速离心5s，将管壁上的乙醇收集到管底后，用小枪头吸净，置于超净台上吹5min左右，最后用50μL DEPC水溶解沉淀，-20℃贮存备用；(2)、RT-PCR扩增反应引物BBTV引物：BBTV-P1：5’-ATGTGGTATGCTGGATGTTC-3’BBTV-P2：5’-GTTCATATTTCCCGCTTTGA-3’CMV引物：CMV-P1：5’-CACCCAACCTTTGTGGGTAG-3’CMV-P2：5’-CAACACTGCCAACTCAGCTC-3’在0.2mL的薄壁PCR管中分别加入去离子水3.5μL、2×buffer12.5μL、扩增酶混合液1μL、扩增BBTV和CMV基因片段的上、下游引物(P1，P2)各1μL(10μmol/L)、香蕉病叶总核酸1μL(0.5μg)，混合均匀后，进行一步法RT-PCR扩增，并以从健康无病毒侵染的香蕉叶片中提取的总核酸为阴性对照；其中RT-PCR扩增过程：50℃30min，94℃3min；然后94℃1min，52℃1min，72℃1min，共35个循环；(3)、电泳分析取5μL反应产物在用1×TAE缓冲液配制的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。