[发明专利]一种柑橘成年态节间茎段遗传转化方法

摘要

一种柑橘成年态节间茎段遗传转化方法，其包括如下步骤：(1)成年态材料消毒，在温室中选取半木质化的新梢，在采枝梢前一周，每隔一天用5wt％的次氯酸钠溶液擦拭枝梢一遍，共擦拭3～4次，然后再将次氯酸钠溶液擦拭过的枝梢剪下，在无菌条件下切割成4～5cm的茎段，用10wt％的次氯酸钠溶液加2～3滴吐温浸泡20～35min，无菌水冲洗3～4次，切割成1～1.5cm的节间茎段备用；(2)转化；(3)抗性芽再生；(5)温室二次嫁接；(6)抗性芽和抗性植株鉴定，采用公知的PCR分析法进行鉴定。本发明柑橘成年态材料消毒效果好，污染率低；不定芽诱导率达48％；抗性芽嫁接成活率达80％以上；再生转化植株没有嵌合现象。特别适合于冰糖橙、脐橙、椪柑等柑橘主栽品种的成年态节间茎段遗传转化。

主权项

1. 一种柑橘成年态节间茎段遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)成年态材料消毒，在温室中选取半木质化的新梢，在采枝梢前一周，每隔一天用5wt％的次氯酸钠溶液擦拭枝梢一遍，共擦拭3～4次，然后再将次氯酸钠溶液擦拭过的枝梢剪下，在无菌条件下切割成4～5cm的茎段，用10wt％的次氯酸钠溶液加2～3滴吐温浸泡20～35min，无菌水冲洗3～4次，切割成1～1.5cm的节间茎段备用；(2)转化，将携带目的基因之农杆菌划线培养在含有100mg/l卡那霉素的YEB液体培养基上，26～30℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，26～28℃振荡培养20～25h，达到菌对数生长期，OD600 ＝0.6～1.0，离心分离，除去上清液，再用悬浮液悬浮备用；将经消毒处理后的1cm左右节间茎段，浸入到农杆菌悬浮液中10～20min，随后转到无菌滤纸上以便吸掉多余的菌液；(3)抗性芽再生，将农杆菌菌液侵染后的成年态节间茎段接种在共培养基：MS+2ip 2mg/l+2.4-D2mg/l培养基上共培养3 d后，转至筛选培养基MS+6BA 1～3mg/l+NAA 0～0.5mg/l+Cef 500mg/l+Km 30mg/l进行选择培养，诱导抗性芽的产生，培养温度26～28℃，光照强度1200～1600lx，光照时间每天14～16h；(4)抗性芽微芽嫁接成苗，用卡里佐枳橙种子，经75％(体积)的酒精消毒30～45s，再用0.1％的升汞消毒6～8min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MS固体培养基上，在26～28℃黑暗条件下恒温培养12～16d的黄化苗用作砧木；将培养的黄化苗切去上胚轴留1.5～2cm长，切去下胚轴留4～6cm长，然后剥取抗性芽茎尖微芽0.5～1mm，采用微芽嫁接法嫁接于砧木上，置于MS液体培养基中光照培养；(5)温室二次嫁接，待抗性芽长到1.5～2.5cm，进行温室二次嫁接，选用一年生盆栽枳壳为砧木，采用劈接法，外套塑料袋，内置吸足水的脱脂棉保湿，塑料袋外套纸袋遮光，待成活后去除套袋；(6)抗性芽和抗性植株鉴定，采用公知的PCR分析法进行鉴定。