[发明专利]牛肝金属硫蛋白的提取方法

摘要

一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，包括用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnSO₄溶液进行5-7次剂量逐级递增的诱导合成金属硫蛋白；定量检测，要求每1g牛肝中金属硫蛋白的含量≥7mg；将检测合格的牛肝脏捣碎，进行预处理和粗提；最后进行分离与纯化，得冻干粉即为金属硫蛋白纯品，含量为96％以上；从而，经锌诱导牛肝合成金属硫蛋白可达到成本低、效果好、产量高、诱导剂来源广、无副作用等特点；且为扩大金属硫蛋白这一重要的生物活性物质的来源、促进金属硫蛋白的研究和应用开辟了新的途径。

主权项

1、一种牛肝金属硫蛋白的提取方法，其特征在于：包括下列步骤：①诱导合成选用健康的犊牛，用颈部肌肉注射ZnSO4溶液进行5-7次剂量逐级递增的诱导合成金属硫蛋白，每次剂量为5-150mg/kg体重，每隔1d诱导1次；②定量检测诱导完后的第1-3d将犊牛屠宰，取肝脏，将所取新鲜样品用去离子水冲洗两次，洗净残血，直接用巯基显色法或间接竞争型ELISA法对金属硫蛋白的含量进行检测，或用定量滤纸吸干后于-20℃下冷冻保存待测；要求每1g牛肝中金属硫蛋白的含量≥7mg；③预处理与粗提将检测合格的上述牛肝脏捣碎，用pH为8.6的Tris-HCl溶液搅拌匀浆，再加入500mLTris-HCl溶液和250mL体积比为1∶0.08的乙醇-氯仿的混合溶液，搅拌10min，冷冻离心，取上清液放入80℃的水浴锅内水浴5min，取出后迅速冷却至室温，再冷冻离心，离心后的上清液即为金属硫蛋白粗提液，放置于4℃备用；其中，离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min；④分离与纯化按体积比为1∶3于金属硫蛋白粗提液中加入无水乙醇，4℃放置过夜后离心，去上清液取沉淀物，再用0.1mol/L的NH4HCO3溶液完全溶解，之后滤纸过滤；用Sephedex G-100层析柱对滤液进行层析，再用0.1mol/L NH4HCO3进行洗脱，流速为20mL/min，每5min收集1管；收集完成后，分别从各试管中取5μl样品，各样品加入10μl 1.2mol/L的盐酸后，再加入395μl的巯基试剂，进行显色定位；取显色最深的样品，在-80℃下冷冻20～30h，得冻干粉即为金属硫蛋白纯品；其中，离心温度为4℃，转速为10000r/min，时间为20min；⑤分装将冻干粉分装待用。