[发明专利]一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法及应用

摘要

本发明涉及一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法和应用，属于生物工程技术领域。首先，构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌，接着构建高效表达cZOT的基因工程菌，制备获得TrxA-cZOT融合蛋白，纯化得cZOT。本发明与已有技术相比较提高了cZOT的表达量，降低了生产成本；只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的TrxA-cZOT融合蛋白，纯化步骤简单，得率高。

主权项

1. 一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法，其特征在于包括以下几个步骤：第一步：构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌采用下列上游引物和下游引物克隆cZOT基因：上游引物 cgggtaccga cgacgacgac aaggagcctc agtc下游引物 ggaattctca aaatatacta tttagtcctt ttttatcPCR得到该片断；用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切该片断，得到cZOT基因；用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述两种基因片段，得到重组质粒pET-32a(+)-cZOT；第二步：构建高效表达cZOT的基因工程菌将重组质粒pET-32a(+)-cZOT转化到大肠杆菌Rosetta gami(DE3)感受态细胞中，在含有抗生素的LB固体培养基上培养16-20h，挑取阳性转化子，获得高效表达cZOT的基因工程菌；第三步：制备获得TrxA-cZOT融合蛋白将筛选出的高产菌株在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.6mM～1.0mM的IPTG诱导表达4～8小时，生产和积累可溶性表达的TrxA-cZOT融合蛋白；离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破碎仪破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集TrxA-cZOT融合蛋白组分；第四步：制备获得cZOT用肠激酶(EK)酶解TrxA-cZOT融合蛋白，23℃～25℃下裂解16～18h，冰浴5min，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到cZOT。