[发明专利]红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分子鉴别方法无效

专利信息
申请号: 200810038835.0 申请日: 2008-06-12
公开(公告)号: CN101302555A 公开(公告)日: 2008-11-12
发明(设计)人: 周选围;林娟;魏雅敏;唐克轩 申请(专利权)人: 上海交通大学
主分类号: C12Q1/04 分类号: C12Q1/04;C12Q1/68
代理公司: 上海交达专利事务所 代理人: 王锡麟;王桂忠
地址: 200240*** 国省代码: 上海;31
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摘要: 一种分子生物学技术领域的分子鉴别方法。该检测方法包括如下步骤:从红豆杉中分离内生真菌并进行保藏和培养;将培养的内生真菌菌丝体洗涤沉淀,研磨成粉末状;内生真菌DNA的提取和纯化;PCR扩增、PCR产物的电泳检测和特异基因序列的测定;通过从内生真菌中能否扩增出650bp大小的特异性条带来区分该菌株是否产紫杉醇;通过化学检测程序进一步确定结果的可靠性。本发明利用特异基因序列对内生真菌是否产紫杉醇进行简单、快速、准确的初步鉴别,为进一步研发和使用奠定了基础。
搜索关键词: 红豆杉 中产 紫杉醇 真菌 分子 鉴别方法
【主权项】:
1、一种利用特异基因序列初步筛选产紫杉醇内生真菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)红豆杉内生真菌的分离、纯化:分离内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯化;(2)内生真菌的培养:将斜面菌株放至28℃活化24h,挑取菌丝接至固体培养基平板上,28℃恒温培养7天后将菌种接至液体培养基,在25-28℃、120rpm条件下培养36-48h;(3)内生真菌DNA的提取和检测:将培养好的菌丝体离心后去上清,加入缓冲液洗涤沉淀3次,将洗涤好的菌丝体研磨成粉末状,然后提取和纯化DNA,最后对提取出的DNA进行检测;(4)内生真菌的PCR扩增和电泳检测;根据GenBank上登录的紫杉二烯合成酶基因的保守序列设计一对引物,进行PCR扩增,通过电泳检测,仅能从产紫杉醇的内生真菌菌丝中扩增出650bp的特异性条带,利用差异进行鉴别,判定筛选结果;(5)紫杉二烯合成酶基因的克隆和鉴定:回收DNA片断,然后用T-A系统将DNA片断与载体连接,转化后对阳性菌落进行序列测定。
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