[发明专利]一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法，首先将硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐、碳酸钠，微量元素溶液按比例配制成具鞘微鞘藻培养液；其次是将具鞘微鞘藻置于培养液中培养并制得具鞘微鞘藻粉；最后从具鞘微鞘藻粉中提取具鞘微鞘藻藻蓝蛋白并将其纯化。本发明所用方法易行、操作方便、安全可靠、产量高、产品质量好，且所用设备简单适用于工业化规模生产。

主权项

1.一种从具鞘微鞘藻中提取藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：A、培养液的配制：按每升水加入硝酸钠0.8～2.5g、磷酸氢二钾0.02～0.05g、硫酸镁0.06～0.09g、氯化钙0.02～0.05g、柠檬酸0.004～0.008g、柠檬酸铁铵0.004～0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001～0.003g、碳酸钠0.01～0.04g，微量元素溶液0.5～2ml，其中微量元素溶液按每100ml蒸馏水中加入硼酸270～300mg、四水氯化锰170～200mg、七水硫酸锌18～25mg、二水钼酸钠15～30mg、五水硫酸铜6～10mg，完全溶解后搅匀制得培养液；B、具鞘微鞘藻的培养：首先是一级培养，将具鞘微鞘藻藻种接入培养液中静止培养或通气培养，调节气流在1.5～3.5L.min-1，光强控制在65～85μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在2.5～5L.min-1，无菌处理，光强控制在75～95μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到新的培养液中通气培养，调节气流在3～6L.min-1，无菌处理，光强控制在70～100μE.m-2.s-1，温度控制在22～35℃，培养5～10天后作为继续培养的接种种源；第四是继续培养，首先是小循环培养池培养，将三级培养后所得的藻种，接入小循环培养池，控制温度在22～35℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m-2.s-1，搅动培养基；其次是大循环培养池培养，将小循环培养池中培养4～7天后的具鞘微鞘藻转接到大循环培养池中，将大循环培养池中控制温度在22～35℃，利用自然光进行光照，控制光照强度在120～180μE.m-2.s-1培养10～20天后的具鞘微鞘藻过滤收得具鞘微鞘藻藻浆；C、具鞘微鞘藻粉的制备：将藻浆经过离心获得具鞘微鞘藻藻泥，经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到具鞘微鞘藻粉；D、具鞘微鞘藻藻蓝蛋白的抽提：向具鞘微鞘藻粉中加入7～10倍重量的0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲溶液，充分搅匀，然后置于-10～-20℃下冰冻，待冻结后取出，置于20～30℃下融溶，待其完全融溶后，再将其冰冻，如此反复冻融3～5次，然后3000～6000rpm离心10～15min，收集上清液，即为藻蓝蛋白粗提液；E、纯化：在冰浴条件下，在藻蓝蛋白的粗提液中加入饱和度为50～70％的硫酸铵避光盐析20～40min，然后在3～5℃下3000～6000rpm离心15～25min，弃除上清液，用一倍体积的0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液溶解沉淀物，避光透析20～30h后离心，取上清液用0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-52离子交换柱，并用0.05～0.1mol.L-1，pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液和0.1～0.3mol.L-1的NaCl溶液洗脱，用收集蓝色组分，冷冻干燥得纯化的藻蓝蛋白。