[发明专利]一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法

摘要

一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法，包括采用针对16SrDNA和18S rDNA的引物扩增污水中浮游生物群落的宏基因组，并进行变性梯度凝胶电泳以获得群落DNA指纹图谱。第一步是提取浮游生物群落的宏基因组DNA；第二步是扩增宏基因组的目标条带；第三步是进行DGGE电泳分离以获得浮游生物群落DNA指纹图谱；第四步是利用DNA凝胶软件分析DGGE凝胶照片，利用条带的光密度值来表示条带，然后利用统计学软件对数据进行分析。本方法方便快捷，重复性好，灵敏度高，成本低廉，可应用于城市污水的生物监测。

主权项

1. 一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法，其特征在于：A.浮游生物群落的宏基因组DNA提取：直接使用采水器采得污水水样，水样充分混匀，吸取混匀水样转入离心管，离心获得沉淀，并去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，再离心一次，将所获沉淀悬浮于灭菌的TENP缓冲液中，接着将沉淀悬浮液振荡混匀，离心去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，然后再次离心，最后将沉淀悬浮于灭菌双蒸水，置于液氮中，室温下融解，待样品完全融解后直接加入裂解液，然后将样品置于水浴箱中温浴裂解过夜，DNA抽提参照使用酚-氯仿抽提法，最后加TE缓冲液溶解，取溶解的DNA进行琼脂糖凝胶电泳评估，其余DNA-20℃保存；B.采用特异性引物扩增污水中浮游生物群落的宏基因组：PCR扩增采用50μL的反应体系，其中包含有：10×PCR buffer(不含Mg2+)，5μL；MgCl2溶液，25mmol/L，4μL；dNTP，2mmol/L，2μL；引物P1和P2或P3和P4，10μmol/L，各0.8μL；Taq酶3.0U；模板DNA 20ng；最后加灭菌双蒸水补足至终体积50μL，采用Touchdown PCR模式，运行条件如下：94℃，5min；然后94℃下变性1min；69℃或67℃下退火30s；72℃下延伸1min，之后每个循环降1℃，共10个循环；再进行18或20个扩增循环，扩增参数为94℃下变性1min；59℃或57℃下退火30s；72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，反应终止于4℃，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳确认目标片段；扩增16S rDNA的引物：正向引物P1：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGC CCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物P2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；扩增18S rDNA的引物：正向引物P3：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGC CCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3’；反向引物P4：5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3’；C.变性梯度凝胶电泳：电泳在INGENYphorU-2 system中进行，所用胶浓度为9％聚丙烯酰胺，配制凝胶的溶液含有：丙烯酰胺21.9156g，N，N′-甲叉双丙烯酰胺0.5844g，50×TAE5mL，最后加灭菌双蒸水补足至终体积250mL，进行两次变性梯度凝胶电泳，以获得群落DNA指纹图谱，第一次采用较宽的变性梯度30％-70％，第二次根据结果调整变性梯度为以获得更好效果，运行条件：在1×TAE缓冲液中，60℃恒温，120V恒电压条件下运行11h，凝胶用溴化乙锭染色，经UVP成像分析系统拍照得到DNA指纹图谱；D.利用软件对图谱进行分析：利用Quantity One软件分析浮游生物群落DNA指纹图谱获得光密度值等数据，利用STATISTICA 6.0软件中的主成分分析功能对数据进行统计分析，获得各个不同污水处理阶段间浮游生物群落DNA指纹数据相对于两个主成分的坐标及基于坐标的二维图。