[发明专利]一种杂交瘤细胞单克隆制备的筛选方法

摘要

本发明涉及一种能够一步实现杂交瘤细胞筛选及单克隆化的培养制备的方法，该方法包括先配制杂交瘤细胞单克隆化半固体培养基，将融合后的细胞加入人类碱性成纤维细胞生长因子，再加入杂交瘤融合及克隆因子，混匀，与半固体培养基轻轻混匀，分装到平皿并于37℃下5％的CO₂条件下培养；待皿中已长出肉眼可见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择阳性孔直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。本发明操作简单，培养周期短，无需饲养细胞，易于一步实现细胞融合后杂交瘤细胞筛选及单克隆制备。

主权项

1.一种杂交瘤细胞单克隆制备的筛选方法，其特征在于(1)配制2倍DMEM基础培养液：取Dulbecco改良型培养基干粉即DMEM干粉10～15克，加纯水300～500毫升，加入3～5克碳酸氢钠并充分搅拌溶解，用0.5～1.5摩尔每升盐酸和0.5～1.5摩尔每升氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤除菌，制得2倍DMEM基础培养液；(2)配制L-谷氨酰胺母液：称取L-谷氨酰胺1～10克，加纯水50-300毫升并加热至完全溶解，除菌过滤，配制得浓度为200毫摩尔每升L-谷氨酰胺母液，按每管4毫升分装，冷冻保存；(3)配制β-巯基乙醇母液：取50～80微升β-巯基乙醇，加入到50-120毫升纯水中，过滤除菌，配制得10毫摩尔每升母液，冷冻保存；(4)配制甲基纤维素水溶液：称取0.6～2.4克4000cp甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素，量取纯水，分别在121～126℃灭菌30分钟，无菌条件下量取17.5～70毫升已灭菌纯水加入到甲基纤维素中，2～8℃低温条件下搅拌20～24小时；(5)HAT半固体培养基配制：在步骤(4)配制的甲基纤维素水溶液中加入步骤(1)配制的2倍DMEM基础培养液15～60毫升，加入步骤(2)配制的L-谷氨酰胺母液0.25～1毫升，加入步骤(3)配制的β-巯基乙醇母液0.5～2毫升，再加入：胎牛血清10～40毫升，市售的100倍MEM非必需氨基酸0.5～2毫升，10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素混合水溶液0.5～2毫升，加入市售的50倍次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶溶液1～4毫升，2～8℃搅拌3～6小时，即得到HAT半固体培养基，也即杂交瘤细胞单克隆化半固体培养基；(6)融合后的细胞放置35～38℃预培养16～24小时，然后用5～20毫升预热至35～38℃的步骤(1)配制的2倍DMEM基础培养液混匀，加入人类碱性成纤维细胞生长因子200-800纳克，再加入杂交瘤融合及克隆因子即HFCS 0.5～2毫升，混匀，再与步骤(5)配制的HAT半固体培养基轻轻混匀，35～38℃静置10～30分钟并排除气泡，分装到平皿并于37℃下5％的CO2条件下培养；(7)培养9～14天，其间不得将平皿或培养板拿出培养箱观察，待皿中已长出肉眼可见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择阳性孔直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。