[发明专利]一种从人乳中分离、纯化骨桥蛋白OPN的方法

摘要

本发明提供了一种从人乳中分离、纯化骨桥蛋白(OPN)的方法。该方法先从人乳样品经高速离心分离出含OPN的乳清，然后采用高效液相色谱配有SCX色谱柱进行初步梯度分离，得到含有OPN的SCX5、SCX6组份，该二组份在C4色谱柱上进一步纯化，最后可以得到纯度较高的骨桥蛋白OPN。使用该方法，步骤简单、快速省时、所用试剂种类少、成本较低。

主权项

1.一种从人乳中分离、纯化骨桥蛋白(OPN)的方法，其特征是按以下步骤进行：(A)将人乳样品经高速离心分离，转速需大于12000转/分钟，温度控制在不超过0℃，离心时间为30～45min，分离出乳脂、乳清和乳粒，其中乳脂在上层、乳粒在下层，OPN在中层的乳清部分中；(B)初步分离：乳清部分用1mol/L硫酸调节至PH为4.6，沉淀，除去酪蛋白后，采用高效液相色谱配有SCX色谱柱进行分离，流动相A为20mmol/L柠檬酸、20mmol/L柠檬酸铵、pH 3.0和流动相B为20mmol/L柠檬酸、20mmol/L柠檬酸铵、0.5mol/LNaCl、pH3.0，进行梯度洗脱，先100％A洗脱20min，然后流动相B含量从0％到10％洗脱10min后，再大幅度使用流动相B含量从60％到100％洗脱10min，在洗脱的过程中保持总流速为1mL/min，柱温为35℃，分离得到八个组份见图1，其中，SCX5、SCX6组份含有OPN；(C)进一步纯化：将SCX5、SCX6组份合并，用高效液相色谱配有C4色谱柱对SCX5、SCX6组份进行纯化，流动相组成为A为0.1％TFA、99.9％水(v/v)和B为0.1％TFA、9.9％水与90％乙氰(v/v)，进行梯度洗脱，先100％A洗脱10min，然后流动相B含量从20％提高到40％，洗脱10min后，流动相B含量从40％到60％，洗脱25min，最后使流动相B含量从60％到100％，洗脱10min，在洗脱的过程中保持总流速为1mL/min，柱温为40℃，可以得到纯度较高的骨桥蛋白OPN。