[发明专利]甘草细胞产业化的培养方法

摘要

本发明公开了一种甘草细胞产业化的培养方法，属于甘草细胞培养技术。该方法包括以下过程：甘草种子以消毒灭菌后接种于MS培养基中培养诱导甘草无菌芽；然后将切下的甘草芽段转移到愈伤组织培养基中固体培养生成甘草愈伤组织；之后将愈伤组织转移到细胞培养基中进行悬浮培养及进行继代培养获得细胞产量稳定的甘草细胞液；最后将甘草细胞液转移到搅拌桨式反应器中进行甘草细胞规模化悬浮培养得到细胞产量按细胞干重计为15～40g/l的甘草细胞悬浮液。本发明具有过程简单，细胞生长迅速、产量稳定等特点。

主权项

1.一种甘草细胞产业化的培养方法，其特征在于包括以下过程：1).将甘草的种子用质量浓度为70％～75％乙醇浸泡10～15秒后，经灭菌的去离子水冲洗2～4遍，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液浸泡15～20分钟，然后经灭菌的去离子水冲洗2～4遍，将其接种于Murashige&Skoog培养基中固体培养，在培养温度为23℃～28℃光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d的培养条件下培养3～5d后种子生出芽，将芽切成小段，转接到愈伤组织培养基中进行培养，所述的愈伤组织培养基由为MS培养基与按每升MS培养基加入1～4mg的2，4-二氯苯氧乙酸、加入0～2mg激动素、加入30～60g蔗糖和加入8～10g琼脂组成，用浓度为1mol/L的NaOH或质量浓度为10％的HCl调节细胞培养基的pH为4.5～7.5，之后在温度为23℃～28℃下避光培养，培养20～25d后，甘草愈伤组织布满培养皿；2).按每克愈伤组织与细胞培养基的毫升体积量1∶10～20的比例，将愈伤组织碎片转入培养基中进行液体悬浮培养，所述的细胞培养基由MS培养基与按每升培养基加入1～4mg的2，4-二氯苯氧乙酸、加入0～2mg的激动素和加入的30～60g蔗糖组成，用浓度为1mol/L的NaOH或质量浓度为10％的HCl调节细胞培养基的pH为4.5～7.5，在温度为23℃～28℃，光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d，摇床转速为90～120r·min-1的条件下悬浮培养4～7d后，对悬浮液进行过滤，滤除较大的细胞团及未完全愈伤化的组织，在得到的分散性较好的细胞悬浮液中，按照细胞悬浮液体积量与加入的细胞培养基的体积量的比为1∶2～5的比例加入细胞培养基，继代培养20～25d后，在继代细胞悬浮液中，按照继代细胞悬浮液体积量与加入的细胞培养基的体积量比为1∶2～5的比例加入细胞培养基得到继代两次的细胞悬浮液，以此继代方法进行5次继代，得到细胞产量按细胞干重计为3～10g/L的细胞悬浮液；3).取步骤2)得到的每升含按干重计3～10g细胞的细胞悬浮液1～1.5L转移到5L搅拌桨式反应器中，按照细胞悬浮液的体积量与细胞培养基的体积量的比例为1∶1～3向反应器中加入细胞培养基，在温度为23℃～28℃，光照强度为800～2000lux，光照时间为12h/d，搅拌速率为80～130r/min，通入空气，通气量为1.5～4L/min的培养条件下进行培养20～30d后收获甘草细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞产量按细胞干重计为15～40g/L。