[发明专利]一种检测弓形虫的半巢式PCR方法

摘要

本发明提供一种检测弓形虫的半巢式PCR方法，通过设置PCR检测试剂盒，被检样品DNA提取，半巢式PCR扩增，扩增产物分析，判定样品为弓形虫感染阳性或阴性。发明的方法，可快速、准确地检测出被检样品中的弓形虫，也可用于弓形虫病的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，常规的方法需经溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化胺等试剂处理，时间长，费用高。本方法建立在分子生物学的基础上，可排除镜检时细菌和杂质颗粒的干扰，从而大大提高诊断准确率，降低假阳性率。

主权项

1.一种检测弓形虫的半巢式PCR方法，通过以下技术方案实现：(1)设置PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：PCR管、阳性对照、阴性对照、Taq DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液；(2)提取被检样品DNA；(3)半巢式PCR扩增；(3)扩增产物分析；其中步骤(1)的PCR管内含10×缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物1、引物2、引物3和MgCl2，所述引物1，引物2和引物3分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段：引物1 5’-GCGTGCGGAAGGACCCACTACAAT-3’引物2 5’-GACTCGGCTGGAAATGC-3’引物3 5’-GCAAGCCACAGCGGAACAACTCAG-3’；所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，通过以下方法构建：将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒含弓形虫226bp基因片段；所述阴性对照为双重蒸馏水；其中步骤(2)所述提取被检样品DNA，是取200μ1无菌抗凝血液，Trizol试剂裂解后常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4℃保存备用；其中步骤(3)所述的半巢式PCR扩增是在PCR检测试剂管中加入步骤(2)处理后的DNA样品，同样设阴性对照和阳性对照，在25μl反应体系中加入：灭菌超纯水 15.37μl10×PCR buffer 2.5μl2.5mmol/L dNTP 2μlP1 1μlP2 1μlP3 1μlTaq酶 0.13μlDNA模板 2μl反应循环条件：94℃4min→94℃1min，62℃30sec，72℃50sec，30个循环→72℃8min→94℃1min，55℃30sec，72℃40sec，30个循环→72℃8min；其中步骤(4)所述扩增产物分析，是将PCR产物进行琼脂糖电泳，被检样品孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照比对，以判定样品为弓形虫感染阳性或阴性。