[发明专利]人干扰素α-2b重组卡介苗及其构建方法和鉴定方法

摘要

本发明涉及一种分泌人干扰素α-2b的重组卡介苗rBCG-IFNα-2b及其构建方法、鉴定方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽片段和人IFNα-2b的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b，然后采用电转化技术将该载体导入BCG中，构建重组卡介苗rBCG-IFNα-2b，依靠pMV261-Ag85B-IFNα-2b在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌人IFNα-2b。本发明得到的重组卡介苗rBCG-IFNα-2b既保留了原有BCG的免疫原性，又能持续分泌细胞因子IFNα-2b，从而提高BCG的免疫活性；IFNα-2b能够直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化，具有更好的抗肿瘤作用，可以减少使用剂量，降低BCG引起的毒副作用；避免了使用外源IFNα-2b所带来的应用剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂和费用高昂的问题。

主权项

1、一种人干扰素α-2b重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)获得人IFNα-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因：设计人IFNα-2b和BCGAg85B的扩增引物，分别从人外周血和BCG基因组中用聚合酶联反应方法提取、扩增人IFNα-2b基因和Ag85B信号肽基因片段，并对其筛选、鉴定，其中人IFNα-2b的上游引物：5′-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3′且含EcoR I酶切位点下游引物：5′-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3′且含Hind III酶切位点，BCG-Ag85B信号肽基因的上游引物：5′-GATGGATCCAATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3′且含BamHI酶切位点下游引物：5′-GTAGAATTCCGCGCCCGCGGTTGCCGCTCC-3′且含EcoRI酶切位点；(2)构建卡介苗穿梭表达载体：利用DNA重组技术将人IFNα-2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因片段插入质粒pMV261结核杆菌hsp60启动子下游，构建分泌型卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b并转化大肠杆菌、抽提和纯化，对pMV261-Ag85B-IFNα-2b进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定；(3)人IFNα-2b重组BCG的构建：利用电穿孔技术将已构建的重组载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b导入BCG，构建重组卡介苗rBCG-IFNα-2b。