[发明专利]用Bac－to－Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法

摘要

本发明公开了一种用Bac－to－Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法。该方法的步骤如下：利用Bac－to－Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子的重组病毒；利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质。本发明的优点在于利用Bac－to－Bac表达系统能够快速产生含有人体内皮血管生长因子基因的重组杆状病毒，并在家蚕幼虫内高效表达，利用肝糖亲和层析柱实现重组蛋白的快速分离和纯化。

主权项

1、用Bac-to-Bac系统在家蚕内表达人血管生长因子的方法，其特征在于该方法的步骤如下：1)利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒的方法：将人体内皮血管生长因子基因克隆入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统配套的供体质粒pFastBacHT多克隆位点，使该基因位于杆状病毒多角体启动子下游，然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素的培养板上培养过夜，翌日通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，随后从阳性菌斑从抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组，将此DNA转染入家蚕培养细胞BmN，120小时后分离培养基上清液，获得含有人体内皮血管生长因子基因的重组病毒；2)利用肝糖层析柱从感染的家蚕体内分离纯化重组的蛋白质方法：利用注射法将20微升上述重组病毒注射入家蚕五龄幼虫，120小时后收集感染的家蚕样品，然后加入磷酸缓冲液并匀浆样品，高速离心后取上清液，将上清液作为提取重组人体内皮血管生长因子蛋白的原料，利用肝糖亲和层析柱分离、纯化获得相应的蛋白质，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白质纯度。