[发明专利]一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法

摘要

一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，它涉及一种检测李斯特菌的方法。本发明解决了现有检测单增李斯特活菌的方法容易产生假阳性的问题。本发明检测单核细胞增生李斯特菌的方法按如下步骤进行：从待测物品中提取菌泥后提取RNA进行反转录及实时PCR；即得到可以判断待测物品是否含有单增李斯特活菌的图谱。本发明具有灵敏度高，特异性好，操作简便，周期较短的优点，适应食品工业中致病菌快速检测的需求。

主权项

1、一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，其特征在于检测单核细 胞增生李斯特活菌的方法按如下步骤进行： 一、取待测物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养 培养8小时，再取培养液4mL放于5mL环氧树脂管中，在室温下以 14000r/min的速度离心3min，得到菌泥； 二、将得到的菌泥重悬于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬 于1mL的裂解液中，然后加入0.2g、直径为0.2mm的玻璃珠，2000转/分涡 旋5min。然后以14000r/min的相对离心力离心3min； 三、取离心后悬浮物700μL与同体积pH值为5.5的水饱和酚混合于 1.5mL的环氧树脂管中，在68℃的条件下保温5min，然后在室温下以 14000r/min的速度离心4min； 四、取600μL的上层水相与同体积氯仿混合于另一个1.5mL的环氧树脂 管中，以2000r/min的速度涡旋20s后，再以14000r/min的速度离心4min； 五、再取400μL上层水相与800μL的绝对乙醇和40μL、浓度为3mol/L 的醋酸钠混合，以2000r/min的速度涡旋20s后，于-20℃保温10min，再以 16000r/min的速度离心5min获得RNA沉淀物； 六、用体积为1mL、质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物，以16000r/min 的速度离心3min后，在室温下干燥至无乙醇残留。 七、将干燥的RNA重悬于20μLDEPC水中，加入DNA酶和RNA酶抑 制剂在37℃下保温15min，再放入60℃的水浴10min； 八、RNA抽提之后进行RT-PCR操作，反转录条件为：在95℃保温2min 后，在42℃保温15min；PCR反应参数为：在95℃的条件下预变性10s， 40个循环中，每个循环均在95℃的条件下变性5s，在60℃的条件下延伸34s， 其中反转录及实时PCR的上游引物为5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’， 下游引物为5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，荧光探针为 FAM-5’-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’-TAMRA；通过荧光监测 系统可接收到荧光信号，收集荧光信号，各循环数的相对荧光值数据通过软 件分析形成图谱，通过图谱判断待检测物品是否含有单增李斯特活菌。 实时PCR反应试剂用量